手工雪茄主要霉菌的分离鉴定及其生物学特性研究

朱贝贝，黄阔，薛芳，安泓汋，叶长文，李栋，李东亮*

1 四川中烟工业有限责任公司雪茄烟技术创新中心，成都市龙泉驿区成龙大道二段 610066；

2 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

雪茄是以发酵醇化的烟叶为原料卷制而成的特殊烟草制品[1]。由于发酵后的烟叶富含有机酸、糖等营养物质，因此更适宜霉菌生长繁殖，进而引发霉变[2-3]。手工雪茄近年来发展迅猛，但雪茄烟支在养护、运输和储存等过程中，受环境温湿度影响造成的霉变现象日益突出。生产过程中发现，手工雪茄因特殊的加工过程面临更大的霉变风险。霉菌在高温、潮湿或无氧等条件下发酵，可导致烟叶腐烂，产生杂气[4]，对雪茄的内在感官及质量安全性产生不利影响[5-6]。据报道，自然界引起商品变质腐败的霉菌有130 属231 种[7]，其中引起烟叶霉变的优势霉菌主要为曲霉属和青霉属[8-10]，也有少量的毛霉、根霉等[11-12]。霉菌生长繁殖的最适条件受自身生物学特性及气候条件影响有很大差异[13]。Welty 等[14]研究表明美国烤烟霉变烟叶81%样品中检测出了匍匐曲霉。Tamayo 等[15]研究表明引起西班牙烟叶霉变的微生物主要为芽孢杆菌和球菌。引起我国烟叶霉变的微生物主要有黑曲霉、烟曲霉、溜曲霉、孔曲霉等[16-19]。引起我国卷烟烟支霉变的主要微生物有黄曲霉、桔青霉和米曲霉等[20-21]。

目前对烟草霉变的研究多集中于烤烟烟叶储存、卷烟加工和储存中霉菌等方面，缺乏对手工雪茄烟支中主要霉菌种类及其生物学特性的研究。为此，本研究通过对市场反馈易霉变的手工雪茄烟支中霉菌含量及种类进行研究，旨在明确引起手工雪茄烟支霉变的主要霉菌及其生物学特性，为雪茄霉变防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：收集市场反馈的易霉变手工雪茄烟支，共9 种，分别命名为A-I。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）；孟加拉红琼脂培养基；高盐察氏培养基；察氏培养基；氯硝胺18%甘油琼脂（DG18）培养基按照说明书配制；10%烟汁培养基的制备：1000 mL 蒸馏水中加入100 g发酵前雪茄烟叶，煮沸后过滤，加水补足到1000 mL，加18 g 琼脂，121℃消毒20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 手工雪茄烟支中霉菌含量的测定

在无菌条件下将手工雪茄烟支样品剪碎、混匀，称取25 g 样品，装入无菌均质袋中，加入225 mL 无菌磷酸盐缓冲液，均质器12 m/s 均质3 min，制成原始菌悬液，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5浓度梯度的菌悬液。参考GB 4789.15—2016 中霉菌计数方法并进行改进，将0.333 mL 稀释液涂布接种于孟加拉红培养基，每组样品设置3 个重复。28℃恒温培养5 d，最终以霉菌含量在10～100 CFU/平板的稀释度平板进行霉菌含量计算。

1.2.2 手工雪茄烟支中霉菌的分离和纯化

选取培养基上菌落形态不同的霉菌，在无菌条件下将不同的霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行纯化，后置于（28±1）℃恒温培养箱培养3～7 d，直至形成单一菌落。

1.2.3 手工雪茄烟支中霉菌的鉴定

形态学观察：通过观察单菌落在生长初期、中期和后期的生长速度、大小、高度、色泽、质地、结构、边缘形状、培养基颜色变化和渗出物等特征，对霉菌菌落形态特征进行初步鉴定。

产孢结构特征分析：将菌落边缘带孢子的菌丝置于载玻片上的乳酸石碳酸液中，菌丝分散均匀后盖上盖玻片通过镜检对霉菌菌丝及霉菌孢子、产孢结构等特征进行鉴定。

ITS 分子生物学鉴定：称取20 mg 干燥的菌丝并用液氮研磨成粉末，使用Ezup 柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒进行 DNA 提取。 利用 ITS1（ 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ） 和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）真菌通用引物对霉菌ITS 区进行PCR 扩增。PCR 反应总体系为25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol /L）0.5 μL，上下游引物（5 μmol /L）各1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL（5 U /μL），无菌水19 μL，DNA 0.5 μL。PCR 反应条件：预变性95℃ 5 min；30 个循环（变性94℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸72℃ 90 s）；总延伸72℃ 10 min。将测序结果在GenBank 上进行Blast 比对，找出与检测菌株序列同源性最高的菌株。运用MEGA 6.06软件，以Kimura 双参数模型和邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育进化树。

1.2.4 手工雪茄烟支中主要霉菌的生物学特性

不同培养基对霉菌生长的影响：选取PDA 培养基；高盐察氏培养基；孟加拉红培养基；察氏培养基；DG18 培养基；10%烟汁培养基对两种主要霉菌进行培养。菌株在28℃恒温培养箱中培养5 d 后，在菌落边缘用内径为5 mm 的打孔器取菌饼，将菌饼移入相应的培养基平板中央，于28℃、75%湿度培养5～7 d 后用十字交叉法测量菌落直径。每个处理设3 次重复。实际生长的菌落直径=菌落直径平均值－5 mm。

不同温度条件对霉菌生长的影响：在无菌条件下，将直径为5 mm 的菌饼移入生长状况良好的培养基平板中央，分别在25℃、30℃、35℃和40℃条件下培养，湿度均设置为75%，5～7 d 后测量菌落直径。每个处理设3 次重复。

不同热处理条件对霉菌生长的影响：分别设40℃、50℃和60℃ 3 个恒温水浴，制备聚多曲霉和产黄青霉孢子悬浮液各2 mL 于无菌试管中，将试管置于相应温度条件下水浴10 min，未进行恒温水浴的孢子悬浮液于室温放置10 min 并作为CK 对照，每个处理设3 次重复，将水浴后的孢子悬浮液均匀涂抹至相对应的培养基平板上培养5～7 d，计算霉菌含量。

不同紫外线照射时间对霉菌生长的影响：制备聚多曲霉和产黄青霉孢子悬浮液，将孢子悬浮液进行梯度稀释至10-7，随后将稀释过的孢子悬浮液均匀涂抹至相对应的培养基平板上，置于生物安全柜中紫外灯下分别照射10 min、20 min、30 min、60 min、120 min，并以紫外光照0 min 为CK 对照。培养5～7 d，计算霉菌含量。每个处理设3 次重复。

不同湿度条件对霉菌生长的影响：在无菌条件下，将直径为5 mm 的菌饼移入生长状况良好的培养基平板中央，分别在湿度为50%、70%和90%下培养，温度均设置为28℃，5～7 d 后测量菌落直径。每个处理设3 次重复。

2 结果

2.1 手工雪茄烟支中霉菌含量

对9 种手工雪茄烟支样品的霉菌含量进行测定，将所得检测数据进行分析，如图1 所示。每组样品的平行性较好，检测结果可靠。A～I 手工雪茄烟支中霉菌的含量范围为0～2.10×104CFU/g。B、C 和G 样品的霉菌含量较高，均大于104CFU/g。

图1 雪茄烟支样品中霉菌含量Fig.1 Mold content in cigar samples

2.2 手工雪茄烟支中霉菌的分离与鉴定

2.2.1 手工雪茄烟中主要霉菌种类及数量占比

根据9 种样品在选择性培养基平板上的霉菌生长情况，将各样品中不同霉菌种类进行编号，根据霉菌菌落的形态学特征对其种类进行到属水平的初步鉴定，并对其含量占比进行分析，结果如表1 和图2 所示：手工雪茄样品中的菌落按照生长形态特征划分共有6 种曲霉属，1 种拟青霉属和1 种青霉属。其中A-1、B-1、C-1、D-1 和I-3 形态学特征相同，为曲霉属同一种霉菌；A-2、B-2、C-2、E-2、H-1 和I-1 形态学特征相同，为青霉属同一种霉菌。为方便后续研究将前者命名为#1，后者命名为#2。其中#1 和#2 在多个样品中有检出，且含量占比较高，为手工雪茄烟中的主要霉菌。

表1 样品主要霉菌种类及含量占比Tab.1 Types and proportion of main molds in cigar samples

图2 雪茄烟样品中主要霉菌种类及形态图Fig.2 The main mold species in cigar samples and their morphological images

2.2.2 雪茄烟支中主要霉菌鉴定

2.2.2.1 主要霉菌形态学特征

#1 型菌株在PDA 培养基上培养5 d 后，菌落形态如图3 所示：菌落直径5～10 mm，棕色，紧密，表面绒状，菌落反面淡褐色，无色素，菌落上无渗出物。#2 在PDA 培养基上菌落形态：正面呈绿色、灰绿色，菌落表面呈不规则形状，菌落反面呈白色、淡黄色。

图3 #1 和#2 在PDA 培养基上的菌落生长形态Fig.3 Colony morphology of #1 and #2 strains on PDA medium

2.2.2.2 主要霉菌产孢结构

从图4 可以看出#1 型菌株的分生孢子穗为黑色、褐黑色或紫褐色，部分发生浅色的突变；分生孢子梗光滑；顶囊大的呈球形或近球形，小的稍膨大，产生小梗；小梗单层或双层；分生孢子粗糙，具有褐黑色的条纹。

图4 #1 和#2 型菌株的产孢结构Fig.4 Spore structure of #1 and #2 strains

#2 型菌株菌丝呈淡绿色，菌丝和分生孢子梗均有横隔，光滑或粗糙；分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，为扫帚状；分生孢子为球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙。

2.2.2.3 主要霉菌的分子生物学鉴定

菌株鉴定的ITS 序列及系统进化树结果如图5、6所示，结合形态学观察和产孢结构特征分析，最终确定#1 为聚多曲霉（Aspergillus sydowii），#2 为产黄青霉（Penicillium chrysogenum）。

图5 #1 系统发育进化树Fig.5 Phylogenetic tree of type 1 strain

图6 #2 系统发育进化树Fig.6 Phylogenetic tree of type 2 strain

2.3 手工雪茄烟支中主要霉菌的生物学特性

2.3.1 不同培养基对主要霉菌生长的影响

如表2 所示，聚多曲霉在DG18 培养基上生长最快，在察氏培养基上生长最慢；产黄青霉在DG18 培养基上生长最快，在烟汁培养基上生长最慢。不同霉菌种类对培养基的选择不同，选择不同培养基对霉菌生长速率有重要影响。

表2 培养基对霉菌生长状况的影响Tab.2 Growth status of molds in different culture mediums

2.3.2 不同温度对主要霉菌生长的影响

如表3 所示，聚多曲霉的最适生长温度为30℃，25～35℃均能生长，40℃时未生长。产黄青霉的最适生长温度为25℃，25～35℃均能生长，在40℃时未生长。

表3 培养温度对霉菌生长状况的影响Tab.3 Effects of temperature on the growth of molds

2.3.3 不同热处理对主要霉菌生长的影响

如表4 所示，聚多曲霉在40℃加热10 min 时霉菌含量高于空白对照，在加热50℃时，霉菌含量从107数量级骤减至103，60℃时霉菌已全部死亡。产黄青霉随着温度的升高，霉菌含量呈现递减的现象，当温度为60℃时，霉菌已全部死亡。

表4 热处理对霉菌孢子浓度的影响Tab.4 Effects of heat treatment on the mold spore concentration

2.3.4 紫外线对主要霉菌生长的影响

如表5 所示，聚多曲霉和产黄青霉对紫外线不敏感。聚多曲霉和产黄青霉经紫外线处理10 min、20 min、30 min、1 h、2 h，霉菌数量没有明显变化。

表5 不同紫外线照射时间对霉菌孢子浓度的影响Tab.5 Effects of different ultraviolet irradiation time on the concentration of mold spores CFU/mL

2.3.5 不同湿度对主要霉菌生长的影响

不同湿度下聚多曲霉和产黄青霉生长直径如表6所示，湿度的增加，有利于聚多曲霉的生长，当湿度为90%时，聚多曲霉生长最快。产黄青霉生长速度随着湿度的增加先增加后减少，当湿度为70%时，产黄青霉的生长速度最快。

表6 培养湿度对霉菌生长状况的影响Tab.6 Effects of humidity on the growth of molds

3 讨论

本研究从9种手工雪茄烟支中分离得到8种霉菌，主要为曲霉属、青霉属和拟青霉属。相关研究表明，曲霉属和青霉属是报道较多的导致卷烟及烟叶霉变的主要霉菌，其中数量最多的是黑曲霉、匍匐曲霉、红曲霉、产黄青霉等[12,22-23]。本研究发现导致手工雪茄霉变的主要霉菌为聚多曲霉和产黄青霉，其中产黄青霉被报道是诱发云南、山东存储片烟霉变的主要霉菌[17-18,24]，而由聚多曲霉引起雪茄霉变的研究尚未见报道。与卷烟及烟叶相比，雪茄烟总氮和生物碱的含量较高，糖含量较低，微生物生长基质不同，优势霉变菌群也不尽相同，而目前国内外尚未见关于手工雪茄霉变微生物的研究。

霉菌的最适生长温度为25～30℃[12]，不同霉菌之间存在差异。聚多曲霉、产黄青霉在DG18 培养基上生长最快，在温度40℃时生长最慢甚至不生长，孢子悬浮液在60℃热处理下失活，紫外照射对其无显著影响；聚多曲霉在湿度为90%时，产黄青霉在湿度为70%时，生长速度最快。因此，在雪茄生产过程中可以通过控制温度或热处理等方式抑制主要霉菌的生长繁殖，进而控制霉变发生。但本研究未能全面了解主要霉菌在雪茄烟支上的生长规律，后续将通过以手工雪茄烟支为介质，研究主要霉菌在雪茄烟支上的生长情况，为手工雪茄霉变的防治提供更具参考价值的技术依据。

4 结论

曲霉属、青霉属和拟青霉属是引起手工雪茄烟霉变的主要霉菌菌属，其中聚多曲霉和产黄青霉是导致手工雪茄霉变的主要霉菌菌株。聚多曲霉和产黄曲霉适宜生长的培养基为DG18，其孢子悬浮液在60℃失活，对紫外照射不敏感。聚多曲霉最适生长温度30℃、湿度90%。产黄曲霉最适生长温度25℃、湿度70%。