猫豆提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

张桂珍，苏 健，胡 颖，江圆圆，黄春韵，李学坚*

（1.广西中医药大学广西中医药科学实验中心，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种由多病因引起的以血糖升高为特征的代谢类疾病［1］。国际糖尿病联盟（IDF）发布的数据显示，2021 年全球糖尿病患者总数约有5.37 亿人，且糖尿病患病率每年在持续增加［2-3］。临床上治疗糖尿病的口服降糖药物主要包括格列奈类、双胍类、二甲基肽酶4（DPP-4）抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂和磺酰脲类等。α-葡萄糖苷酶抑制剂可通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，减缓淀粉转化为葡萄糖的速率，减少小肠对葡萄糖的吸收，从而达到降低餐后血糖的目的［4］。从天然产物中筛选糖苷酶抑制剂是开发降糖药物的策略之一，目前研究人员已经从药用植物中提取或分离出数个具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的活性成分［5-8］。

猫豆是豆科黧豆属植物，为广西特色药用植物，广西是最主要的产区［9］。猫豆具有多种有效成分，从其中提取的左旋多巴在帕金森综合征的临床治疗中发挥着重要的作用［10-11］。此外实验研究也显示猫豆提取物在糖尿病大鼠模型实验中具有明确的降血糖作用［12-14］。为进一步探讨其降糖作用机制，本实验采用系统溶剂法制备猫豆不同部位（根、茎、叶、花、豆和豆荚）的提取物，研究各提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并筛选出相应的活性成分。

1 实验材料

1.1 药材与试剂 猫豆采自广西百色市，经广西中医药大学中药鉴定教研室滕建北教授鉴定为豆科植物猫豆Mucuna pruriensvar.utilis（Wall.ex Wight）Baker ex Burck。将猫豆植株清洗干净，把根、茎、叶、花、豆和豆荚分开，在阴凉处晾干，备用。α-葡萄糖苷酶（货号G8823，批号12021013，规格为1KU）和阿卡波糖（货号A9281，批号1228D031，纯度＞95%）购自北京索莱宝科技有限公司；对硝基苯酚葡萄糖苷（PNPG，货号N8390，批号505Q021，纯度＞98%）购自美国Sigma公司；提取用的溶剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器 Epoch2T 全波长酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；XEVO G2 QTOF高分辨质谱仪、H-class超高效液相色谱仪（美国沃特斯公司）；EYE4 旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；Alpha 1-2 LDplus 冻干机（德国Christ 公司）。

2 方 法

2.1 猫豆各植株部位提取物的制备 称取干燥的猫豆根50 g，粉碎成粗粉，加入1 000 ml 乙醇冷浸24 h，期间不时搅拌，过滤，滤液于旋转蒸发仪上挥去乙醇，得到乙醇总提取物。用50 ml 氯仿∶水（1∶1）溶液使其溶解，振荡萃取10 min，离心，分离氯仿层和水层。氯仿层置于水浴锅中挥干氯仿，向残渣中加入50 ml 正己烷和60%甲醇（1∶1）溶解，振荡萃取10 min，离心，分离上层，挥去溶剂后得到正己烷提取物；甲醇层依次用四氯化碳和氯仿各振摇萃取10 min，分离出各层提取物，挥去溶剂后分别得到四氯化碳提取物、氯仿提取物和甲醇提取物。向上述的水层加入25 ml 水饱和正丁醇，振摇萃取10 min，离心，分离上下层，挥去溶剂分别得到正丁醇提取物和水提取物Ⅰ。将前述乙醇提取后的植物残渣挥去溶剂，加入1 000 ml 蒸馏水，冷浸24 h，过滤，滤液冻干后得到水提取物Ⅱ。用上述方法分别制备猫豆的茎、叶、花、豆和豆荚的提取物。上述得到的各部位提取物，分别用含6%二甲基亚砜（DMSO）的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，制备成浓度为1.0 mg/ml、0.1 mg/ml、0.01 mg/ml的提取物溶液，用于α-葡萄糖苷酶活性抑制实验。将上述正己烷提取物和四氯化碳提取物用乙腈溶解，氯仿提取物、正丁醇提取物、甲醇提取物和水提取物（Ⅰ，Ⅱ）用50%乙腈溶解，分别制成1 mg/ml 的溶液，用于液相质谱分析测定。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性的测定 反应在96孔板中进行。每孔反应液总体积为180 μl，其中α-葡萄糖苷酶溶液（2 U/ml）30 μl，0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）72 μl；对照组加入阿卡波糖溶液（5.6 mg/ml）18 μl，猫豆不同提取物组加入各浓度的提取物溶液18 μl，空白组加入6% DMSO PBS 溶液18 μl，混合均匀，于37 ℃下预热10 min后，再分别加入底物溶液（2.5 mmol/L）60 μl 启动反应。酶标仪测定波长为405 nm，温度为37 ℃，每隔5 min 测定吸光值1 次，检测总时长为20 min。

2.3 半数抑制浓度计算 以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制反应曲线并计算其斜率。通过比较斜率计算出每个提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率，将各提取物在不同浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制率输入SPSS 24.0 统计分析软件，计算出半数抑制浓度（IC50）。

2.4 色谱方法 色谱柱：Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温：40 ℃；流动相：乙腈-水（含0.1%甲酸）为1∶1；流速：0.3 ml/min；进样量：3 μl；梯度洗脱程序：0～5 min，5%乙腈；6～30 min，乙腈浓度由5%升至100%。

2.5 质谱方法 采用ESI 离子源的，正离子灵敏度模式，离子源温度为100 ℃，脱溶剂温度为450 ℃，毛细管电压为3.0 kV，椎孔电压为40 V，脱溶剂气流为650 L/h，椎孔气流为50 L/h，质谱信号采集模式为连续MSEContinuum 模式，低能级碰撞能量为6 V，高能级碰撞能量为20～40 V，质量校正及采集范围50～2 000 Da，质谱信号通过MasslynxTMV 4.1软件采集。

2.6 已知化合物标准库的建立 查阅国内外历年文献［15-20］，收集整理已报道的黧豆属植物所含化合物共84 个。在Chemspider、Chemicalbook 以及NAPSS 数据库上下载这些化合物的mol 文件，合并成猫豆标准化合物库，用于化学成分比对分析。

2.7 质谱数据处理方法 将采集到的质谱信号原始数据导入分析软件Progenesis QI，使用内标物亮氨酸脑啡肽进行质量校正，然后再对原始数据进行峰对齐、归一化和峰提取等预处理。根据糖苷酶抑制实验结果将IC50值小于100 μg/ml 的提取部位归为低IC50组，其余归为高IC50组，导入Ezinfo（3.0）软件进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。用下列条件对识别出的化合物离子碎片进行筛选：同一碎片在低IC50组的信号丰度与在高IC50组的信号丰度相比＞1.2，方差分析（ANOVA）结果P＜0.05，vip 值＞1。标记筛选出的化合物，即对α-葡萄糖苷酶具有高抑制作用的化合物。将筛选出的化合物离子碎片信息在分析软件Progenesis QI 与猫豆标准化合物库中进行比对分析。如离子碎片中母离子与标准化合物的质量误差小于10 ppm，二级碎片与理论碎片质量误差小于5 ppm，同位素相似度大于80%，则可标记出相应的化合物名称。

3 结 果

3.1 猫豆提取物对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度（IC50） 猫豆的根、茎、叶、花、豆和豆荚的不同溶剂提取部位对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度如表1 所示，大部分提取部位对α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，其中根的正丁醇提取部位，叶的水提取物Ⅰ和甲醇、正丁醇、氯仿提取部位，豆荚的甲醇、正丁醇和氯仿提取部位，对α-葡萄糖苷酶的IC50均小于10 μg/ml，显示出较强的抑制作用。

表1 猫豆不同溶剂提取部位对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度（μg/ml）

3.2 高分辨质谱分析结果 质谱总离子流图如图1、图2所示。猫豆各植物部位的不同溶剂提取部位的化合物存在明显的差异。经正交偏最小二乘法判别分析及方差分析所筛选出的碎片离子，再与猫豆标准化合物库进行比对，共比对出在低IC50组中高表达的13个化合物：山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷、山柰酚-3-O-鼠李半乳糖苷、7-羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮、大豆异黄酮、花旗松素、柚皮苷查尔酮、高丽槐素、mucunone A 和2′-hydroxy-biochanin A 等9 个黄酮类化合物，以及3-hydroxy-2-methyl-2，3-dihydrobenzofuran-4-carboxylic acid、新喋呤、3-甲基吲哚、丁二酸等4 个其它化合物，结果见表2、表3。这些化合物多分布在正丁醇、甲醇及氯仿提取部位。

图1 猫豆根、茎、叶各提取部位质谱总离子流图

图2 猫豆花、豆、豆荚各提取部位质谱总离子流图

表2 猫豆中对α-葡萄糖苷酶呈强抑制作用的化合物

表3 13个化合物在猫豆各植物提取部位的分布情况

4 小 结

猫豆是广西特色药用植物，具有镇静安眠、降血糖等作用，异黄酮类化学成分可能是其降血糖的活性成分之一［21］。本实验从猫豆中筛选出对α-葡萄糖苷酶具有强抑制作用的13 个化学成分，其中山柰酚-3-O-β-D-槐糖苷、山柰酚-3-O-鼠李半乳糖苷［22］、花旗松素［23］、高丽槐素［24］和mucunone A［21］均已被报道对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，本实验结果与以往报道一致。

猫豆对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用的化学成分多分布在甲醇、正丁醇和氯仿提取部位，经质谱分析筛选出的13 个化合物中，有9 个为黄酮类化合物，且主要分布在正丁醇提取部位，提示其活性成分多为中等极性的化合物。乙醇提取后的药渣再经水提取制备所得的水提取物大部分没有显示出活性，提示猫豆中的水溶性大分子化合物缺乏对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，在后续的研究中应主要围绕小分子化合物开展实验。从植物部位来看，有较强抑制活性的提取物主要分布在叶与豆荚，因此猫豆的叶与豆荚有望被开发成为新的药用资源。

本实验证实了猫豆对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，并从猫豆中筛选出对糖苷酶具有强抑制作用的13个化学成分，可作为进一步研究猫豆降血糖作用的目标化合物。