高强度超声与低氯化钠盐协同作用下鲢鱼糜凝胶的品质变化

高霞，冯庆祥，胡杨，尹涛，尤娟，熊善柏，刘茹

（华中农业大学食品科学技术学院，长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心（武汉），湖北武汉 430070）

鱼糜制品因高蛋白、低脂肪、营养价值丰富而广受消费者的喜爱[1,2]。商业生产时，需加入2%～3%氯化钠（Sodium Chloride，NaCl）使鱼糜中的盐溶性蛋白充分溶解[3]。加热过程中，溶出的蛋白伸展并暴露部分活性基团[4]，分子间发生相互作用，形成有序结构的弹性凝胶体[5,6]。但是，盐含量摄入过多易引发心血管疾病，不利于人体健康。诸多学者报道了鱼糜制品生产时的减盐措施，包括使用钠盐替代物、添加外源亲水胶体、使用新兴高新技术等[7-9]。其中，前期实验室研究[10,11]发现高强度超声波技术（10～1000 W/cm2，20～100 kHz）可促进肌球蛋白溶解，提高低盐（1%，m/m）鱼糜凝胶的质构性能，但降低了高盐（＞3%）鱼糜凝胶的质构性能，推测这与超声强度及盐含量等因素有关。目前，大多数研究集中于超声强度或盐含量单因素对鱼糜凝胶性能的影响[12-14]，然而，关于超声功率、时间及盐含量三者同时施加对鱼糜凝胶性能的影响鲜有报道。

二次旋转正交设计是一种将正交与回归融为一体的试验方法，可用较少的实验组合实现与完全实施实验相同项数的回归模型，并且旋转性使得预测值的方差处处相等[15]。应用二次旋转正交试验可同时研究多个单因素水平对响应值的影响，是一种较好的设计方案。

本实验以鲢鱼糜为原料，采用二次旋转正交设计研究超声功率、时间及盐含量三者同时对鱼糜凝胶TCA-可溶性肽的影响，同时测定鱼糜凝胶色度与持水性的变化，通过建立非线性回归方程、绘制响应面解析三因素的贡献度及因素间的交互作用，探讨超声处理对不同盐含量鱼糜中蛋白质降解情况及凝胶品质的影响，以期为高强度超声辅助鱼糜凝胶的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻鲢鱼糜[AAA级，水分含量为73.26%（m/m）]，由井力水产食品有限公司提供。福林酚、氯化钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；K600食品调理机，德国博朗电器公司；TA-XTPlus质构仪，美国Stable micro system公司；1750型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；色度计，美国Hunter Lab公司；硬度计，日本Kiya Seisakusho公司。

1.3 方法

1.3.1 高强度超声波处理与鱼糜凝胶样品制备

取150 g鱼糜于真空袋（160×240×0.2 mm）中并封口，将其置于超声清洗槽中，加入4 L冰水控制超声温度为（15±2）℃进行超声处理。

鱼糜凝胶的制备参考本实验室前期[16]的方法。将鱼糜用食品调理机空斩3 min，通过添加冰水调节水分含量至78%，加入NaCl后继续斩拌5 min。斩拌后的肉糜经抽真空、灌肠后，于40 ℃加热1 h、90 ℃加热0.5 h。加热结束后，立即将鱼糜凝胶置于流动水下冷却，然后转移至4 ℃冰箱存放过夜，第二天进行相关指标的测定。

研究高强度超声功率单因素对鱼糜凝胶质构性能的影响时，实验参数设置为：功率0～300 W，时间10 min，盐含量2%（m/m）；研究超声时间单因素对鱼糜凝胶质构性能的影响时，实验参数设置为：时间0～40 min，功率180 W，盐含量2%（m/m）；研究盐含量单因素对鱼糜凝胶质构性能的影响时，实验参数设置为：盐含量0～2%（m/m），功率180 W，时间15 min。

1.3.2 质构性能测定

将鱼糜凝胶于室温中平衡0.5 h，剥去肠衣后，切成2 cm高的圆柱体。选用P/0.25S球形探头测定样品的破断力与凹陷深度，测试参数设置为：探头运行程序Return to start，测前速度2 mm/s，测中速度1 mm/s，测后速度2 mm/s，触发力5 g。每个样品测试6～10个平行。

1.3.3 TCA-可溶性肽测定

取3 g鱼糜凝胶样品，加入5%（m/V）冷的TCA溶液（27 mL），并用高速分散机于6000 r/min下均质1 min。均质液于4 ℃下放置1 h，10000 r/min离心10 min后保留上清液。上清液中TCA-可溶性肽含量的测定参考Lowry法[17]，用酪氨酸作标曲。

1.3.4 色度测定

将鱼糜凝胶切成5 mm厚的薄片，使用色度计测定样品的L*（亮度值）、a*（红绿值）、b*（黄蓝值）。鱼糜凝胶的白度值（Whiteness，记为B）按下式计算：

式中：

B——白度；

L*——亮度值；

a*——红绿值；

b*——黄蓝值。

1.3.5 持水性测定

将样品切成5 mm厚，记录其质量W1，用三层滤纸包裹薄片，使用硬度计对其施加5 kg恒力并持续3 min，去除滤纸后称量样品质量，记为W2。持水性（Water Holding Capacity，WHC）按下式计算：

式中：

C——持水性（WHC），%；

W2——压后样品质量，g；

W1——压前样品质量，g。

1.4 试验设计

根据单因素实验结果，运用中心组合设计原理[6]，以超声功率、时间及盐含量为自变量，TCA-可溶性肽、色度及持水性为响应值，设计二次旋转正交试验，因素水平表及组合设计表分别见表1、表2。采用SAS9.0软件对二次旋转正交试验结果进行非线性回归拟合，二阶多项式如下：

表1 二次旋转正交设计因素水平表Table 1 Factor level table of quadratic rotation orthogonal design

表2 二次旋转正交设计及试验结果Table 2 Results of quadratic rotation orthogonal design

式中：

Y——响应值；

β——方程的回归系数；

Xi、Xj——因素水平。

1.5 数据分析

所有实验均进行三次重复，每次至少3个平行，实验数据以平均值±标准偏差表示。采用Origin 9.0软件作图，SPSS 22.0软件中的Duncan方法进行显著性检验，P＜0.05表示数据间差异显著。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 高强度超声功率对鱼糜凝胶破断力与凹陷深度的影响

高强度超声功率对鱼糜凝胶破断力与凹陷深度的影响如图1所示。与对照组相比，超声处理后鱼糜凝胶的破断力显著升高（P＜0.05），且随着超声功率增大呈现先上升后下降的趋势，在240 W时获得最大值（452.21 g），较对照组提高了19.64%。有研究表明鱼糜凝胶的破断力与蛋白质分子间的相互作用有关[18]。鱼糜中的功能性蛋白是盐溶性肌球蛋白[11]，其良好的分散性是促进分子间相互作用的重要前提。前期研究发现[10]高强度超声处理显著提高了肌球蛋白的溶解度，这有利于提高鱼糜凝胶的破断力。类似地，尹艺霖等[19]研究表明增大超声功率促进了肌原纤维蛋白的分散性，从而提高了蛋白凝胶性能。此外，由图1可知，鱼糜凝胶的凹陷深度随超声功率增大呈现先升高后趋于稳定的趋势。当超声功率为180、210、240 W时，鱼糜凝胶的破断力与凹陷深度无显著差异（P＞0.05），故选取180 W超声功率为二次旋转正交设计的零水平值。

图1 高强度超声功率对鱼糜凝胶破断力与凹陷深度的影响Fig.1 Effect of HIU power-on the breaking force and deformation of surimi gels

2.1.2 高强度超声时间对鱼糜凝胶破断力与凹陷深度的影响

根据上述实验结果，固定超声功率为180 W，研究了超声时间对鱼糜凝胶破断力与凹陷深度的影响，结果见图2。鱼糜凝胶的破断力随着超声时间延长呈先升高后下降的趋势，在15 min时获得最大值440.10 g，较未超声处理提高了8.90%。高强度超声处理适当时间时，其产生的空穴效应及高剪切力、微射流等机械效应能够提高鱼糜中蛋白质分子的分散性[20]，这有利于促进热诱导过程中蛋白质间发生相互作用，破断力增大；然而，超声时间过长时，蛋白质易发生降解[21]，从而降低了鱼糜凝胶的破断力。类似地，Zhang等[22]研究发现相较于超声时间15 min时，超声处理30 min后虾肉糜凝胶的破断力显著降低（P＜0.05）。此外，鱼糜凝胶的凹陷深度随超声时间延长无显著变化（P＞0.05）。

图2 高强度超声时间对鱼糜凝胶破断力与凹陷深度的影响Fig.2 Effect of HIU time on the breaking force and deformation of surimi gels

2.1.3 盐含量对鱼糜凝胶破断力与凹陷深度的影响

图3为盐含量对鱼糜凝胶破断力与凹陷深度的影响。未添加NaCl时，样品的破断力与凹陷深度较低，仅为193.03 g、5.46 mm。随着盐含量升高，鱼糜凝胶的破断力与凹陷深度显著增大（P＜0.05），当盐含量为2.0%（m/m）时，其破断力与凹陷深度较对照组分别提高了127.16%、97.89%。鱼糜胶凝过程中，蛋白质分子（尤其盐溶性蛋白）发生解折叠暴露出活性位点，促进了分子间相互作用，形成质地良好的弹性凝胶体[2]。低盐环境中，肌球蛋白主要以组装体形式存在[23]，溶解性较低，限制了加热过程中蛋白质分子的变性与聚集，从而鱼糜凝胶质地较差。增加盐含量提高了肌球蛋白的溶出与分散性[10]，有利于热诱导时蛋白质分子充分伸展，从而促进分子间发生相互作用，使得鱼糜凝胶的破断力与凹陷深度显著增大。该结果与Cando等[24]的报道一致。

图3 盐含量对鱼糜凝胶破断力与凹陷深度的影响Fig.3 Effect of NaCl contents on the breaking force and deformation of surimi gels

2.2 二次旋转正交试验

在单因素实验基础上，分别选取超声功率180 W、时间15 min及盐含量1.5%（m/m）为中心水平，设计三因素五水平的二次旋转正交实验，结果见表1。

2.2.1 高强度超声处理对不同含盐量鱼糜凝胶TCA-可溶性肽的影响

TCA-可溶性肽可表征蛋白质的降解程度，其数值越大说明小分子肽含量越多，蛋白质降解程度越高[16]。采用二次旋转正交设计研究了超声功率、时间及盐含量对鱼糜凝胶TCA-可溶性肽的影响，结果如表2所示。二次旋转正交设计共包含23组实验，其中9组设置为零水平的重复实验。

对表2结果进行方差分析，结果见表3。方差分析结果表明，回归方程Y=0.5198-0.0015X1-0.0048X2-0.1162X3+0.000002X12+0.00002X1X2+0.00005X22+0.0003X1X3+0.0175X32具有显著性（R2=0.93，P＜0.01），说明该模型适用于描述本实验条件下TCA-可溶性肽的变化。

表3 TCA-可溶性肽的回归系数与方差分析Table 3 Regression coefficients and analysis of variance of the regression models for TCA-soluble peptides

根据主因素回归系数的绝对值判断，盐含量对TCA-可溶性肽的影响最大，超声时间次之，超声功率的影响最小。观察表3发现，超声功率、时间均与TCA-可溶性肽呈极显著负相关（P＜0.01）。鱼糜中含有内源性蛋白酶[25]，可将蛋白质水解为小分子肽。据此结果推测超声波处理可抑制内源性蛋白酶的活性，削弱了其水解能力。有研究表明超声波与传统加热联用可有效抑制过氧化氢酶的活性[26]，胃蛋白酶和胰蛋白酶经305.62 W/cm2强度超声处理18 min后，活性分别下降了15%和50%[27,28]，类似地，Zhang等[29]通过研究超声波辅助凝胶化发现超声波处理抑制了罗非鱼内源性蛋白酶的活性。关于超声处理对内源性蛋白酶活性的影响及机理有待进一步研究。

此外，方差分析指出盐含量与TCA-可溶性肽呈极显著负相关（P＜0.01），即TCA-可溶性肽随盐含量升高而降低，这可能与内源性蛋白酶活性受离子强度影响有关。前期研究发现[11]，当盐含量提高至5%时，鱼糜中TCA-可溶性肽较1%盐含量时下降了23.22%。相似地，Ohkubo等[30]对白鱼中内源性蛋白酶活性的研究发现，增大盐含量至3%即可抑制蛋白酶的活性。

由表3可知，X1X3（超声功率-盐含量）、X1X2（超声功率-时间）的交互作用对TCA-可溶性肽具有显著影响（P＜0.05），因此绘制响应面解析两因素间的交互作用，结果见图4。由图4a可知，低盐条件下（0、0.5%），TCA-可溶性肽随超声功率升高而降低，说明超声处理协同低盐条件可抑制蛋白质的降解，推测这与超声处理抑制蛋白酶活有关。该结果一定程度上解释了高强度超声协同低盐后鱼糜凝胶的破断力与凹陷深度升高[31]；然而，高盐条件下（2%、3%），TCA-可溶性肽随超声功率升高而升高，这不利于鱼糜凝胶品质。盐含量增加，鱼糜中肌球蛋白的溶解性提高，推测分散性良好的蛋白质分子经超声处理后更易发生降解，易损害鱼糜的凝胶品质。观察图4b发现，超声功率较低（≤150 W）时，随时间延长，鱼糜凝胶的TCA-可溶性肽含量逐渐降低；然而，当超声功率高达240 W时，TCA-可溶性肽随超声时间延长逐渐升高。该结果说明，当超声强度较低时，延长超声时间有利于更大程度地抑制蛋白酶活性，但是当超声强度较大时，长时间超声处理也会造成蛋白质分子降解，产生更多TCA-可溶性肽。

图4 超声功率-盐含量（a）与超声功率-时间（b）的交互作用对TCA-可溶性肽的影响Fig.4 Effect of interactive effect of HIU power-salt contents (a)and HIU power-time (b) on the TCA-soluble peptides

2.2.2 高强度超声处理对不同含盐量鱼糜凝胶色度的影响

色度是评价鱼糜制品品质的重要指标[32]，由表4可知，色度的回归模型均具有显著性（P＜0.01）。超声功率与L*、b*、白度值显著正相关（P＜0.01），增大超声功率可获得白度较大的鱼糜凝胶，推测这与超声处理诱导形成了致密的凝胶结构有关[33]，从而样品表面光反射率变大，白度值增加。此外，盐含量与a*、b*呈显著负相关（P＜0.01），即盐含量降低，鱼糜凝胶的红绿值、黄蓝值增大。a*取决于鱼糜中肌红蛋白的含量[34]，当盐含量降低时，鱼糜在胶凝过程中易发生蒸煮损失，析出较多水分，推测肌红蛋白的浓度因此增大，导致a*升高。Pietrasik和Li-Chan[6]也报道了类似的结果。超声时间对各指标无显著影响（P＞0.05）。进一步观察表4发现，超声功率、时间及盐含量间的交互作用对色度影响不显著（P＞0.05）。

表4 色度的回归系数与方差分析Table 4 Regression coefficients and analysis of variance of the regression models for color values

2.2.3 高强度超声处理对不同含盐量鱼糜凝胶持水性的影响

持水性可用于表征蛋白质与水分子之间的结合能力[35]。方差分析（表5）显示，持水性方程具有显著性（R2=0.85，P＜0.01），且鱼糜凝胶的持水性与盐含量成正比（P＜0.01），即增大盐含量，鱼糜凝胶持水性随之提升。随盐含量升高，由于电荷屏蔽效应使肌原纤维蛋白之间的静电斥力增大[10]，肌球蛋白溶出增多，蛋白质分散得更好，形成的凝胶网络更加致密均匀[11]，提升了对水分子的截留能力。

表5 持水性的回归系数与方差分析Table 5 Regression coefficients and analysis of variance of the regression models for WHC

观察表5发现，超声功率及时间对鱼糜凝胶持水性无显著影响（P＞0.05），这似乎与前期实验[16]相矛盾，但其实不然，本实验的超声参数与文献报道存在差异。另外，由表5可知，盐含量对持水性的影响最大，其回归系数（29.435）远大于超声功率（0.032）与时间（0.228）的回归系数，推测盐含量水平削弱了超声功率及时间水平对凝胶持水性的影响。

3 结论

用于评价鱼糜凝胶品质的模型均具有显著性（P＜0.01），且各因素对鱼糜凝胶品质影响的贡献度依次为盐含量＞超声时间＞超声功率。主因素分析表明盐含量与TCA-可溶性肽呈负相关，增大盐含量可抑制蛋白质降解，从而获得持水性较高和红度值较低的凝胶体。此外，交互作用分析揭示了低盐与超声功率间存在协同效应，增大超声功率降低了低盐鱼糜中蛋白质的降解程度，提高了其持水性。综上，高强度超声波的应用可抑制低盐环境中蛋白质的降解，这有利于提高低盐鱼糜的凝胶性能。