羊乳酪蛋白酶解物的改善睡眠作用

朱秋轶，刘果，龙明芳，刘星雨，乔子骄，宋玉，曾志安，殷光玲，曹素芳，曹庸

（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642）（2.华南农业大学财务处，广东广州510642）（3.汤臣倍健股份有限公司，广东广州 510663）（4.澳优乳业（中国）有限公司，湖南长沙 410200）

人类一生中大约有三分之一的时间处于睡眠状态[1]，睡眠质量与身心健康密切相关。在现代的快节奏生活中，慢性压力[2]、焦虑[3]、抑郁[4]、轮班工作[5]和营养不良[6]等环境因素严重影响睡眠质量，睡眠障碍会导致各种健康问题，包括肥胖[7]、糖尿病[8]和高血压[9]等疾病。

我国超3亿人存在睡眠障碍[10]，使用安眠药和镇静抗抑郁药对慢性失眠进行药物治疗已被广泛采用，但是长期使用这些合成药物常常伴随耐受性、依赖性等不可忽视的副作用，包括睡眠质量较差、觉醒次数增多、快速眼动睡眠受损或受到抑制等[11]。因此，挖掘副作用小或无副作用的新型助眠物质成为近年来的研究热点和难点。

生物活性肽是从蛋白质衍生的片段，在人体中发挥多种生理功能。乳蛋白中包含丰富的生物活性肽，已经从乳蛋白中分离出了具有促睡眠作用的活性肽[12-15]。Dela等[12]研究发现牛乳酪蛋白酶解物（150 mg/kg）能够延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠，同时大鼠脑电波记录结果表明，牛乳酪蛋白酶解物（150 mg/kg）显著增强大鼠的慢波睡眠时长。Yayeh等[14]使用脑电波信号监控大鼠睡眠期间的清醒、非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠状态，结果表明，牛乳酪蛋白酶解物（300 mg/kg）显著延长大鼠的睡眠时长并减少睡眠-觉醒周期次数。Kim等[15]在临床研究中发现牛乳酪蛋白酶解物可以改善睡眠质量并且具有良好的耐受性，长期给药可能会产生累积的促睡眠效果。

随着人们对羊乳质量和营养认知度的不断提高，羊乳产品越来越流行。市场上的羊乳产品主要有鲜羊乳、羊奶粉、酸羊乳和羊奶酪等，但是羊乳资源的深度开发不足。因此，对羊乳蛋白进行酶解，挖掘对人体健康有益的生物活性肽符合现阶段羊乳制品深加工的需求。据报道，羊乳蛋白的酶解过程可以产生具有抗高血压、抗氧化、降糖、抗炎、抗菌、阿片类或免疫调节活性的多肽[16-20]，但羊乳酪蛋白及其酶解产物的促睡眠活性却鲜有研究。本实验对GMCH改善小鼠睡眠的功能进行研究，并初步探究其改善睡眠的作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级6～8周BALB/c近交性小鼠，雄性，体质量均为18～22 g，由广东斯嘉景达生物科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK（粤）2020-0052，环境温度25～30 ℃，湿度35%～50%，实验方案经华南农业大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 材料与设备

羊乳酪蛋白，澳优乳业有限公司；戊巴比妥钠、巴比妥钠，美国Sigma公司；5-HT、GABA、NA和DA检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；地西泮，山东信宜制药有限公司。

EnSpire酶标仪，美国PerkinElmer公司；万分之一天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Supermaze动物行为学分析软件，上海欣软信息科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GMCH的制备

称取适量酪蛋白置于烧杯中，以料液比1:10加入超纯水，胰蛋白酶添加量为0.4%（m/m），酶解2.5 h，使用2 mol/L的NaOH溶液调节酶解液pH，酶解过程中pH值维持在8.0，酶解温度控制为40 ℃。酶解完成后，加热至95 ℃，维持10 min以使胰蛋白酶失活。随后冷却到室温，4000 r/min离心10 min，取上清液冻干，得到GMCH干粉。

1.3.2 动物分组及处理

将200只小鼠分四批进行实验，每批50只，随机分为5组，分别为空白组、GMCH低剂量组、GMCH中剂量组、GMCH高剂量组和地西泮阳性组，每组10只。GMCH低、中、高剂量组的给药剂量分别为100、400、700 mg/kg，地西泮阳性组的给药剂量为3 mg/kg，灌胃容量均为0.2 mL/20 g，空白组灌胃同等体积蒸馏水，每天灌胃一次，连续灌胃4周。

1.3.3 直接睡眠实验

末次给药1 h后观察小鼠是否进入睡眠状态，睡眠状态的判断取决于翻正反射是否消失。将小鼠于背卧位放置60 s，期间动物如果没有翻转则判定翻正反射消失，翻正反射消失至恢复期间认为动物处于睡眠状态[21]。

1.3.4 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

参考文献[22]的方法并略作改动，通过预实验确定戊巴比妥钠的给药剂量为40 mg/kg，在各组小鼠末次给药1 h后腹腔注射戊巴比妥钠，注射量为0.2 mL。记录各组小鼠睡眠时间，观察不同受试样品对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响。

1.3.5 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

参考文献[22]的方法并略作改动，通过预实验确定戊巴比妥钠的给药剂量为25 mg/kg。在各组小鼠末次给药1 h后腹腔注射戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量，注射量为0.2 mL，认为翻正反射消失1 min以上的动物进入睡眠状态，记录动物注射完成后在30 min内的入睡只数。

1.3.6 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

参考文献[22]的方法并略作改动，通过预实验确定巴比妥钠的给药剂量为250 mg/kg。在各组小鼠末次给药1 h后腹腔注射巴比妥钠，注射量为0.2 mL，注射完成至翻正反射消失期间为入睡潜伏期，记录各组小鼠入睡潜伏期，观察不同受试样品对小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。

1.3.7 旷场实验

参考文献[23,24]的方法并略作改动，整个旷场实验需要在安静的环境下进行，旷场反应箱高50 cm，底边长50 cm，底部中心区域为25 cm×25 cm，其余部分为边缘区域。实验人员每次操作需保持一致，由固定角度将小鼠沿壁放入箱内适应1 min后，开始进行摄像和计时。通过摄像头记录小鼠活动情况，每只小鼠测试5 min并记录其运动轨迹，旷场实验完成后，清洁旷场箱，避免旷场箱内壁及底面留下气味及排泄物等。记录小鼠运动总路程、静止总时间，平均运动速度、中央停留次数。

1.3.8 下丘脑神经递质的含量测定

参考文献[25]的方法并略作改动，实验小鼠测试观察完毕后，使用CO2麻醉，心脏取血后冰浴开颅取出大脑，分离出下丘脑，称重后放入液氮保存备用，随后按照1:9的比例添加生理盐水，在4 ℃条件下匀浆，匀浆液在3000 r/min，4 ℃条件下冷冻离心15 min，取上清液到2 mL离心管中。放于-80 ℃冰箱备用。分别取下丘脑上清液按照试剂盒操作说明测定5-HT、GABA、DA和NE的含量。

1.4 数据分析

所有实验均至少重复三次，实验结果以平均数±标准差（mean±SD）表示，通过SPSS 25.0软件采用单因素方差分析法进行显著性分析，P＜0.05为显著差异。

2 结果与讨论

2.1 GMCH对小鼠体质量与脏器系数的影响

动物体内各个脏器质量与动物体质量的比值为脏器系数，在正常情况下脏器系数一般不会有明显差异。由下表可知，相较与空白对照组，阳性对照组和GMCH低、中、高剂量组小鼠的体质量与脏器系数均无显著差异，表明低、中、高剂量GMCH并未对小鼠产生器质性的影响。

表1 小鼠体质量与脏器系数表Table 1 Body weight and organ coefficient of mice

2.2 GMCH改善小鼠睡眠的试验评价

2.2.1 GMCH对小鼠直接睡眠的影响

各组小鼠在给予相应的受试样品后，1 h内均未发生翻正反射消失的现象，说明GMCH对小鼠无直接睡眠作用。

2.2.2 GMCH对小鼠延长戊巴比妥钠睡眠时长的影响

通过戊巴比妥钠睡眠实验验证GMCH具有改善睡眠的作用。戊巴比妥钠和巴比妥钠是已知的GABAA受体激动剂，当GABA或GABAA受体激动剂与GABAA受体结合时，CI-离子通道打开，导致细胞超极化，细胞兴奋性降低，睡眠发生[26]。具有促进睡眠作用的受试物可以延长巴比妥类药物引起的睡眠时间[27]。由表2可知，GMCH可以显著延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时长。与空白组相比，阳性组睡眠时间延长71.02%（P＜0.05），GMCH低、中、高剂量组小鼠睡眠时间分别延长34.46%、48.83%（P＜0.05）、63.19%（P＜0.05），随着给药剂量的提升，小鼠的睡眠时间也在延长。说明GMCH与戊巴比妥钠有协同作用，可以显著（P＜0.05）延长小鼠睡眠时间。Dela等[12]发现150 mg/kg和300 mg/kg的牛乳酪蛋白酶解物可以显著延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时长。

表2 GMCH对小鼠戊巴比妥钠睡眠时长的影响Table 2 Effects of goat milk casein hydrolysates on sleep duration of sodium pentobarbital in mice

2.2.3 GMCH对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠的影响

由表3可知，空白组小鼠注射戊巴比妥钠溶液阈下剂量后的入睡率为10%，阳性组小鼠入睡率较空白组提升70.00%，GMCH低、中、高剂量组的小鼠入睡率较空白组分别提升20.00%、60.00%、80.00%，样品组小鼠入睡率随着GMCH剂量的提升而增加。Qian等[28]的研究表明，与对照组（58.33%）相比，酪蛋白酶解物组（100 mg/kg，66.67%）、十肽组（2 mg/kg，75.00%）和阳性组（1 mg/kg，91.67%）的睡眠率均有所提高。

表3 GMCH对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量入睡率的影响Table 3 Effect of goat milk casein hydrolysates on sleep rate of mice with sodium pentobarbital subthreshold dose

2.2.4 GMCH对小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

由表4可知，与空白组相比，阳性组入睡潜伏期缩短140.74%（P＜0.05），低剂量组入睡潜伏期缩短42.86%（P＜0.05），中剂量组入睡潜伏期缩短56.63%（P＜0.05），高剂量组入睡潜伏期缩短91.18%（P＜0.05），随着GMCH剂量的提升小鼠的睡眠潜伏期也在缩短。结果表明，GMCH与戊巴比妥钠有协同作用，可以显著缩短小鼠的睡眠潜伏期。结合2.2.1～2.2.3节的结果，说明GMCH具有改善小鼠睡眠的作用。黄远英等[29]经口灌胃给予小鼠不同浓度酪蛋白水解物与γ-氨基丁酸复配剂后，200、600 mg/kg剂量组较空白组睡眠时长显著延长12.23%、10.08%，入睡潜伏期显著缩短7.50%、6.32%，受试物无直接睡眠作用。Chen等[30]使用核桃肽和γ-氨基丁酸组合治疗小鼠30 d，结果显示，小鼠睡眠时长呈剂量依赖性增加，分别增加21.74%，20.23%和28.10%，中、高剂量组小鼠入睡率显著增加，入睡潜伏期显著减少。

表4 GMCH对小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期的影响Table 4 Effect of goat milk casein hydrolysates on sleep latency of sodium barbitone in mice

2.3 GMCH对小鼠行为学的影响

2.3.1 GMCH对小鼠运动轨迹的影响

为了判断GMCH对小鼠是否有镇静作用，设置旷场实验观察小鼠行为学变化。由图1可知，与阳性组和GMCH样品组相比，空白组小鼠在旷场中的活动区域主要分布在边缘且运动轨迹更为密集，这表明GMCH和阳性药物能够减轻小鼠在旷场中的焦虑感。

图1 小鼠运动轨迹图Fig.1 Mouse motion track

2.3.2 GMCH对小鼠旷场指标的影响

旷场实验用于测试动物的自发活动和探索行为，中央区停留时间以及进入中央区的次数可作为评价动物焦虑状态的指标[31,32]，动物在旷场中的活动越少表明药物的镇静作用越强[12]。由表5可知，空白组小鼠在旷场中的中央停留次数、平均运动速度、静止总时间、运动总路程分别为5.80、31.88 mm/s、87.41 s、9560.30 cm，与空白组相比，GMCH低、中、高剂量组小鼠在旷场中的运动总路程有所减少，中央停留时间、中央停留次数和静止总时间均增多，但无显著差异，阳性组小鼠在旷场中的中央停留时间、中央停留次数和静止总时间与空白组相比有显著增多（P＜0.05），以上指标在一定的程度上反映了GMCH有改善小鼠在旷场中的焦虑状况的趋势。梁曹雯等[23]的研究表明，酸枣仁百合睡眠肽复合物处理后，大鼠在中央停留次数、中央区停留时间、总静止时间增加，运动总路程减少，但无显著性差异。Dela等[12]分别以75、150、300、500 mg/kg的牛乳酪蛋白酶解物灌胃小鼠，与空白组相比，小鼠的运动总路程有减少的趋势，但没有显著性差异。

表5 GMCH对小鼠旷场运动的影响Table 5 Effect of goat milk casein hydrolysates on open field movement in mice

2.4 GMCH对小鼠下丘脑中神经递质含量的影响

为了初步探讨GMCH改善睡眠的作用机制，本实验采用ELISA法测定了小鼠下丘脑中的5-HT、DA、GABA、NE的含量。由表6可知，空白组小鼠下丘脑中GABA、5-HT、DA和NE的含量分别为78.60、158.40、659.40、129.20 ng/g。与空白组相比，GMCH低、中、高剂量组均能明显升高小鼠脑内GABA和5-HT含量（P＜0.05），GABA含量分别增加64.72%、41.16%、56.19%，5-HT分别增加25.87%、33.50%、43.67%。随着GMCH剂量的提升，小鼠下丘脑中GABA和5-HT的含量也在增加，但次于阳性组；GMCH低、中、高剂量组小鼠下丘脑中DA和NE的含量较空白组显著降低（P＜0.05），DA含量分别降低7.02%、12.85%、13.72%，NE含量分别降低18.73%、23.37%、29.41%，低、中、高剂量GMCH对小鼠下丘脑中DA和NE的降低作用与给药剂量呈负相关。这些结果在相关文献中有类似的报道[23,33-35]。

表6 GMCH对小鼠下丘脑5-HT、GABA、DA、NE含量的影响(ng/g)Table6 Effects of goat milk casein hydrolysates on the contents of 5-HT, GABA, DA and NE in mouse hypothalamus (ng/g)

下丘脑是调节睡眠-觉醒模式的中心枢纽，同时分布着唤醒区域和睡眠区域。下丘脑中的神经递质系统已经在实验动物中进行了广泛的研究[36]，如5-HT、NE、腺苷、DA、GABA、组胺、下丘脑素等，这些系统在对睡眠障碍治疗的应用中有巨大潜力[37,38]。DA能神经元分布在相对较少的小大脑区域，包括腹侧被盖区（VTA）、黑质致密部（SNpc）、腹侧导水管周围灰质（VPAG）和一些下丘脑区域[39]。DA是一种兴奋性神经递质，在调节运动控制、认知和唤醒方面具有重要作用[40]。GABA是一种非蛋白氨基酸，作为一种主要的抑制性神经递质存在于哺乳动物大脑中，也是改善睡眠障碍的已知药物[41]。GABAA受体上的BZD结合位点是大多数镇静催眠药的靶点。5-HT是最早被证明与睡眠-觉醒周期相关的神经递质之一，有研究表明，5-HT参与睡眠的准备、触发和维持[42]。抑制5-HT能神经元的活性会导致失眠，这种失眠可以通过在视前区注射5-羟色氨酸来逆转，这表明5-羟色胺在大脑结构中是睡眠所必需的[43]。NE在中枢神经系统中主要由蓝斑（Locus Coeruleus，LC）产生，NE能神经元活性在清醒时高，在NREM阶段降低，在REM睡眠期间几乎沉默[44]。NE能神经元在清醒时抑制VLPO区域（诱导睡眠），而VLPO区域的抑制解除是睡眠的关键前提[45]。本研究的结果表明，GMCH降低了下丘脑中兴奋性神经递质DA、NE的含量，提高了下丘脑中抑制性神经递质GABA、5-HT的含量。已有的实验结果显示，GMCH改善睡眠的作用似乎与调节中枢神经系统多神经递质途径有关，但GMCH是否参与到神经递质的转运及与不同类型受体的结合过程，以及在GMCH中起到核心作用的标志性物质还未被筛选出来，这些内容都需要进一步的研究。

3 结论

本课题组对GMCH的生物活性进行了筛选，发现GMCH具有改善睡眠的作用。在戊巴比妥钠诱导的睡眠实验中，地西泮和不同剂量的GMCH均可延长戊巴比妥钠睡眠时长、提高戊巴比妥钠阈下剂量入睡率、缩短睡眠潜伏期，其中GMCH的促睡眠功效随着给药浓度的增加而增强，在700 mg/kg时达到峰值。观察不同剂量GMCH对小鼠在旷场中自主活动的影响，结果表明，不同剂量组GMCH减少了小鼠在旷场中的运动总路程同时增多中央停留次数、中央停留时间和静止总时间，但与空白组相比均无显著性差异，GMCH在旷场实验中有抑制动物活动的趋势，但没有明确的镇静作用。神经递质测定结果表明，GMCH各剂量能提高小鼠下丘脑中5-HT和GABA的含量同时减少DA 和NE的含量。综上，GMCH具有较好的改善睡眠作用，其作用途径可能与其调节下丘脑中神经递质水平有关。