荷叶碱对小鼠肝AML-12细胞内脂质代谢的影响

徐豪，王雪竹，俞卓利，高靖汝，郭瑞，李娇妹，李松涛，韩强

（1.浙江中医药大学公共卫生学院，浙江杭州 310053）（2.浙江中医药大学中医药科学院，浙江杭州 310053）

荷叶，是睡莲科植物莲的干制叶，自古以来就被当作药物和食物同时使用，具有清暑化湿、升发清阳，凉血止血的功效[1]，主要分布在黄河流域、长江地区、珠江中下游，尤以湖北、湖南、浙江、江苏等南方各省为主[2]。现代药物化学发现，荷叶含有荷叶碱、黄酮、多糖和挥发油等化合物，具有降压降脂、抗氧化、抗炎和抗癌等多种作用[3-6]。因此，荷叶茶或者含有荷叶成分的食品或药物受到社会各界越来越多的关注，市场对于荷叶药材的需求也越来越大，但目前市面上所售的荷叶药材成分不一，各种组分相差较大[7]，对于荷叶药材的药效有很大影响。《中国药典（2020版）》规定以Nuci含量作为荷叶质量的衡量标准，目前研究发现不同产地、不同品种和不同处理方式会影响荷叶中荷叶碱的含量[8-11]，但同一产地不同品种对荷叶中Nuci含量影响鲜有报道。因此，有必要研究同一产地不同品种的荷叶中有效成分的含量差异。

近年来，高脂血症（Hyperlipidemia，HLP）的发病率逐年上升，且呈年轻化趋势[12]。高脂血症主要指体内血脂水平异常升高，临床上表现为TG、总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）的升高和（或）高密度脂蛋白胆固醇（High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）的降低，是动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等严重危害机体健康的疾病的主要致病因素[13-15]。肝脏是体内脂质代谢的重要场所，是脂质沉积的主要器官，肝脏的脂质代谢水平与高脂血症、糖尿病、脂肪肝等心血管疾病密切相关[16]。因此，维持肝脏的脂质稳态对于预防和治疗高脂血症具有重要意义。

荷叶碱（Nuciferine，Nuci）是荷叶的主要活性成分，据研究，荷叶碱具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗癌、降血压等多种生物活性，是一种具有多种药理作用的植物生物碱[17-20]。研究发现，荷叶碱可以通过抑制脂质合成蛋白SCAP、SREBP-1c、SREBP2等和促进脂质分解蛋白CPT-1a、CD36、ACC、ATGL等对高脂小鼠肝脏脂质蓄积起抑制作用。荷叶碱可明显改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐量能力[21]，减少动脉粥样硬化动物模型或泡沫细胞模型中泡沫细胞内脂质沉积[22]。

因此，本研究以荷叶及荷叶碱为研究对象，对荷叶品种间荷叶碱含量进行分析，并初步探究荷叶碱对AML-12细胞的降脂作用及其机制，为荷叶的选材及相关降脂产品的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

荷叶于2022年7月采摘自西湖荷花栽培基地（中国，杭州），采摘25种不同品种荷叶（春晓、秋水长天、金合欢、牡丹莲、矮寿金莲、粉玲珑、喜相逢、牢头红、红台莲、碧莲、金珠落玉盘、金凤、粉层托珠、小台红、女儿红、佛座莲、落花绻、藤壶莲、红石榴、念恩、逸心莲、转冬药、黄匙、之江鸿运、小水红）；于60 ℃烘干24 h，水分烘干后粉碎过60目，得荷叶粉末，于-20 ℃保存。

AML-12细胞由中国科学院上海细胞库提供，经浙江中医药大学脂代谢实验室传代保存。

荷叶碱（纯度≥98%），批号：H04211807002，成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈、甲醇，分析纯，德国Merck公司；三乙胺，分析纯，上海麦克林公司；冰醋酸，色谱纯，上海麦克林公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清，美国 Gibco公司；甘油三酯试剂盒，南京建成生物工程研究所；噻唑蓝（MTT），美国Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO），美国Sigma公司；抗体AMPK、P-AMPK和ATGL，美国Abcam公司；油红O染色试剂盒，上海碧云天生物技术公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体，武汉博士德生物技术有限公司。

1.1.2 仪器设备

Waters e2695型高效液相色谱仪，美国沃特世公司；SK3300H超声波表面清洗器，上海科导仪器责任有限公司；MR-4100多功能酶标仪，美国Dynatech公司；AxioObserverA1研究级倒置显微镜，德国蔡司集团；CLASS1003111型细胞培养箱，美国Thermo公司；SW-CJ-IF型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；Tanon-6200化学发光成像仪，上海天能科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 荷叶品种间荷叶碱含量测定

1.2.1.1 荷叶碱提取液制备

经前期单因素试验和正交试验对荷叶碱提取工艺进行优化，确立荷叶碱的最佳提取工艺。精确称取5.0 g干燥荷叶粉末，在90～100 ℃的水浴环境下，用15倍体积的水，蒸汽回流提取2次，每次60 min，合并两次提取液，放置备用。

1.2.1.2 色谱条件

1.2 仪器与试剂 BACT/ALERT 3D全自动细菌培养仪及配套血培养瓶（BioMerieux，法国），VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定及药敏分析系统（BioMerieux，法国），药敏纸片（Oxoid，英国），5%哥伦比亚羊血琼脂培养基和M-H培养基（迪景，广州）。

依据中华人民共和国药典（2020年版）：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂Inert Sustain C18（4.6 mm×1500 mm，5 μmol/L）；流动相为乙腈-水-三乙胺-冰醋酸（27:70.6:1.6:0.78，V/V/V/V）；流速为1.0 mL/min；色谱柱柱温为25 ℃；仪器进样量为20 μL；酶标仪检测波长为270 nm。

1.2.1.3 标准曲线的绘制

参考文献[23]，将荷叶碱标准储备液配制成质量浓度为3、15、30、60、90、120 μg/mL的标准液，用HPLC检测荷叶碱峰面积，HPLC图如图1所示。以标准溶液摩尔浓度为横坐标（C），以峰面积为纵坐标（S），绘制标准曲线：线性回归方程为S=65652C-26483，R2=0.9992。试验结果表明，荷叶碱质量浓度在3～120 μg/mL范围内与峰面积存在良好的线性关系。为保证标准曲线的准确性，对标准曲线进行了精密度、重复性和加标回收率试验，结果表明标准曲线准确可靠，可用于荷叶中荷叶碱含量的检测。

图1 荷叶碱标准品HPLC图Fig.1 HPLC diagram of nuciferine standard

1.2.1.4 品种间荷叶碱含量测定

分别精密称取25种荷叶粉末5.0 g，每种3份，按照1.2.1.1的步骤制备荷叶提取液，并在1.2.1.2色谱条件进行检测分析，记录各品种荷叶碱峰面积，根据标准曲线线性回归方程计算出荷叶碱的质量分数。

1.2.2 荷叶碱降脂试验

1.2.2.1 药液配制

将油酸溶解于氢氧化钠溶液中，然后加入质量分数10%的BSA，稀释至摩尔浓度为3 mmol/L，得油酸钠盐溶液。精确称取2.95 mg荷叶碱，将其加入1 mL二甲基亚砜溶液中充分溶解，配制成摩尔浓度为10 mmol/L的母液，并于-40 ℃保存。

1.2.2.2 细胞培养及实验分组

将AML-12细胞复苏后，置于体积分数5% CO2、37 ℃恒温恒湿培养箱中，用DMEM/F-12培养基培养，待细胞生长密度到达70%～80%时，进行细胞传代接板用于开展后续实验。实验中细胞分为4组：UT组（完全培养基）、OA组（含0.4 mmol/L油酸）、Nuci-25 μmol/L组（含0.4 mmol/L油酸和25 μmol/L荷叶碱）、Nuci-50 μmol/L组（含0.4 mmol/L油酸和50 μmol/L荷叶碱）。

1.2.2.3 细胞毒性实验

参考文献[21]，取对数生长期的AML-12细胞以每孔5000个均匀接种于96孔板上，待细胞贴壁后，加入DMEM/F-12培养基，并添加不同摩尔浓度的候选物在37 ℃恒温培养箱中干预24 h。干预结束前4 h，在96孔板中加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，放入培养箱继续干预4 h，弃掉旧培养基，加入100 μL DMSO，待充分溶解后，在酶标仪570 nm波长处测量吸光度。

1.2.2.4 甘油三酯（TG）测定

按南京建成甘油三酯试剂盒说明书的方法检测AML-12细胞内TG含量。以蒸馏水做空白对照，取培养液上清离心，吸取2.5 μL上清液于96孔板中，再加入250 μL工作液，37 ℃孵育10 min，孵育完成后在酶标仪510 nm波长处测吸光度。细胞蛋白浓度使用BCA试剂盒检测。检测结果表示为每克细胞总蛋白中所含的甘油三酯的质量浓度（mg/g）。

1.2.2.5 油红O染色

按碧云天油红O染色试剂说明书对AML-12细胞进行固定及染色。在干预结束后，缓慢吸除细胞培养液，接着用PBS洗涤2次，再加入4%（m/V）多聚甲醛固定液固定10 min，PBS漂洗2次，加入染色洗涤液覆盖细胞20 s，随后吸除染色洗涤液，加入油红O染色工作液覆盖细胞，37 ℃染色10 min，吸除油红O染色工作液，再加入染色洗涤液，静置30 s，吸去染色洗涤液后用PBS洗涤2次，再用苏木素染色液对细胞核进行5 min常温复染，加入染色洗涤液清洗，最后吸除染色洗涤液，用PBS反复洗涤，在显微镜下观察和拍照。

1.2.2.6 蛋白免疫印迹实验

参照文献[24]，在处理后的AML-12细胞中，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，用BCA试剂盒检测样品蛋白质浓度，并将各组蛋白质浓度调平。将样品蛋白质等量上样，用10%SDS-PAGE电泳分离蛋白质，再低温转移至PVDF膜，用含5%（m/V）脱脂奶粉的TBS-T溶液室温封闭1 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜。TBS-T洗膜3次，加入二抗室温摇床孵育1 h。采用数字凝胶成像仪对拍摄图像，通过Image J软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.3 数据统计分析

所有数据用SPSS 25.0软件系统进行统计分析，用GraphPad Prism 8软件系统绘图。数据以平均值±标准差（±s）表示，组间差异用单项ANOVA比较，P＜0.05时，表示差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 不同品种对荷叶中荷叶碱含量的影响

《中国药典（2020版）》规定以荷叶碱含量作为荷叶药材质量的衡量标准。由表1可知25种荷叶中荷叶碱含量在0.22～0.68 mg/g之间，其中金凤、腾壶莲和牡丹莲等品种中荷叶碱含量低于如佛座莲、落花绻、逸心莲等高荷叶碱含量品种，差异甚至可达3倍。本次研究发现同一产地不同品种荷叶中荷叶碱含量差异明显，这与罗栩强等[25]报道的不同产地的荷叶药材中荷叶碱含量存在差异的研究理论相似。

表1 不同品种荷叶中荷叶碱含量表（n=3）Table 1 Results of alkaloid content in different varieties of lotus leaves (n=3)

2.2 荷叶碱及油酸对AML-12细胞活性的影响

由图2可知，不同浓度的荷叶碱（6.25、12.5、25、50、100 μmol/L）和不同浓度的油酸（50、100、200、400、800 μmol/L）处理24 h后，各组细胞活性与UT组比较无统计学差异（P＞0.05），即荷叶碱（6.25～100 μmol/L）和油酸（50～800 μmol/L）都没有对AML-12细胞活性有损伤,这与Li[21]的研究结果一致。研究根据人体推荐饮荷叶茶量、荷叶的荷叶碱含量及人和小鼠给药换算比例[26]，确定荷叶碱给药浓度为25 μmol/L和50 μmol/L。

图2 AML-12细胞的活力变化Fig.2 Changes in viability of AML-12 cells

2.3 荷叶碱对细胞内甘油三酯含量的影响

大量研究表明，甘油三酯蓄积在高脂血症的发病中起着重要的作用，是引起高脂血症的主要原因。大量甘油三酯在肝脏中积累，使得肝细胞脂肪变性，肝脏脂质代谢紊乱，从而导致高脂血症、肥胖、肝硬化甚至肝癌等疾病的发生[27]。为了探究荷叶碱在AML-12细胞中起降TG作用，在建立高脂模型后，用25 μmol/L和50 μmol/L的荷叶碱溶液干预作用16 h。由图3可知，25 μmol/L和50 μmol/L荷叶碱组中TG含量分别降低了26.52%和33.17%，差异具有统计学意义（P＜0.05），结果表明荷叶碱能抑制AML-12细胞中的甘油三酯的蓄积情况。

图3 各组细胞内甘油三酯含量Fig.3 Intracellular triglyceride content in each group(¯x±s, n=3)

2.4 油红O染色结果

由图4可知，UT组细胞没有着色，而模型组在0.4 μmol/L油酸处理24 h后，细胞周围可见黄褐色脂滴，细胞着色明显；荷叶碱联合油酸共同处理后，细胞内脂滴密度和着色均有所降低（P＜0.05），且随着荷叶碱摩尔浓度的增加，抑制作用也越明显。在李晨驰[28]的研究结果中也发现蓝莓花青素对油酸所致的AML-12细胞脂质蓄积有一定改善作用，油红O染色程度随蓝莓花青素干预降低，这与本研究和汪娇等[29]的结果相似。

图4 荷叶碱对油酸所致的AML-12细胞脂质蓄积的影响（400×）Fig.4 Effect of nuciferine on oleic acid-induced lipid accumulation in AML-12 cells

2.5 蛋白免疫印迹实验

采用Western blot测定细胞内蛋白表达水平，结果由图5可知，AML-12细胞暴露于油酸后，AMPK的磷酸化水平明显降低（P＜0.001），ATGL表达水平降低（P＜0.05）。在添加荷叶碱共同培养后，AML-12细胞中AMPK的磷酸化水平显著提高，ATGL的表达水平回升。Ma等[30]、王艳等[31]、赵丹丹等[32]的研究报道表明，AMPK能在各种代谢相关器官中不同程度的表达，并且可以被细胞压力、运动状态和影响细胞能量代谢的物质等条件激活，并在激活后发挥促进炎症、肿瘤和糖脂代谢正向调控的作用。在本次研究中观察到，荷叶碱能抑制油酸诱导的P-AMPK和ATGL蛋白表达量降低，提示AMPK/ATGL信号通路参与了荷叶碱对AML-12细胞的降脂作用。

图5 各组细胞内蛋白表达情况Fig.5 The expression of intracellular protein in each group(¯x±s, n=3)

3 结论

本研究通过HPLC法对同一产地不同品种的25种荷叶所含荷叶碱含量进行分析比较，发现不同品种间荷叶中荷叶碱含量差异较大，同时，在建立AML-12细胞脂质蓄积模型后，发现荷叶碱对油酸诱导的AML-12细胞脂质蓄积存在一定抑制作用，通过检测相关蛋白表达水平发现，这可能是通过激活AML-12细胞内AMPK/ATGL通路，调节胞体能量代谢平衡来实现。本研究为荷叶相关产品的选材和开发利用提供参考，也为治疗高脂血症提供一个潜在的可能性药物。