随机扩增多态性DNA分子标记技术在肠球菌分型中的应用

付竹贤，关仁梅，王淑敏，陈偲，罗璠

（1.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部四川省重点实验室，四川成都 610041）（2.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041）

肠球菌是传统发酵食品中常见的菌株[1]，因其具有明显益生作用，目前广泛应用于奶酪、泡菜、香肠等发酵食品以及动物饲料生产中[2]。肠球菌是一类来源广泛、功能多样而且又具有致病性的微生物种类，由于其抗逆性强的特点，近年来常被作为益生菌用于饲料工业中，同种类和来源的肠球菌其功能、致病性和抗生素抗性就可能存在较大差异，因此肠球菌种的准确鉴定就显得尤为必要[3]。肠球菌种类丰富，不同种的肠球菌益生性及安全性也有明显差异，近年来肠球菌异位感染现象增多，肠球菌使用的安全性受到质疑，因此快速准确区分种间肠球菌差异对于其合理使用及临床治疗都有重要意义[4]。

随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）是一种快速的基因分析鉴定法，自20世纪90年代问世以来，因其操作简便快速、条带丰富、容易分型等特点，广泛应用于物种遗传亲缘关系分析、物种鉴定[5-8]等方面。该技术利用随机引物对样品进行扩增，事先不需要知道被测样品的基因序列，扩增的多态性条带可用于样品间亲缘关系的分析[9-12]，且简单灵敏、经济便捷，鉴于RAPD的明显优势，目前在多种生物分型鉴定中广泛被采用[13-19]。RAPD技术在细菌的基因分型研究中有深入地研究和应用，如Eduardo等[20]利用RAPD-PCR分型技术对Malasseziaspp.进行分析，可以得出不同来源的菌株彼此间的亲缘关系，且发现特异性的扩增带能够区分各菌株。Marisa等[21]利用RAPD技术对芽胞杆菌进行分型鉴定，结果表明芽胞杆菌在属内存在很高的多态性。Christian等[22]比较了16S rDNA和RAPD-PCR技术检测对171株乳酸菌分离株的鉴定结果，结果均为弯曲乳杆菌、桑弗朗西斯乳杆菌和肠球菌，两者的鉴定结果相同。

在细菌分类学中可以使用几种管家基因在种属水平上进行鉴定分析，因为它整合了细菌染色体周围不同分子钟的信息，除16S rDNA基因，管家基因rpoA（编码RNA聚合酶α链）测序对肠球菌属的物种鉴定具有较高的鉴别力，也被用于肠球菌种水平鉴定[23]。肠球菌种间差异度小，常用的16S rDNA分析不能准确区分种间肠球菌差异，目前常用于细菌基因分型的分子生物学方法，如随机扩增多态性DNA技术（RAPD）、脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）和扩增片段长度多态性分析（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）等[24]，在肠球菌种间大规模快速鉴定中的应用还未见系统深入研究和相似度的分型标准。

因此，本研究通过构建RAPD筛选体系和分型标准，为肠球菌菌群规模化快速鉴定提供可行的方法。

1 材料与方法

1.1 菌株

已知菌株：屎肠球菌（Enterococcus faecium）B13、1003、999、1056、888、7’、106、166、1020、1018、1062、1208、1232、141、451、1074、1096；

耐久肠球菌（Enterococcus durans）15、130、426、22-2、1029、127、10’、178、1451；

海氏肠球菌（Enterococcus hirae）39、1019、1021、1041、1061、1065；

以上32株肠球菌使用16S rDNA结合rpoA管家基因鉴定。

未知肠球菌：1042、401、461、472、1231、1246、115、147、1004、1005、1009、1010、1011、1014、1016、1017、1024、1026、1027、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1037、1038、1044、1045、1049、1050、1051、1054、1055、1057、1059、1060、1064、1066、1069、1073、1082、1087、1099、1101、1008。

以上46株菌株均分离纯化于农家传统泡菜，使用16S rDNA鉴定到属水平。

1.2 主要仪器设备

立式自动压力蒸汽灭菌器，厦门致微仪器有限公司；精密电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；微波炉，广东美的厨房电器制造有限公司；高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；超净工作台，中国青岛海尔有限公司；电热恒温培养箱，天津泰斯特设备有限公司；超微量核酸蛋白测定仪，上海学静生物科技有限公司；智能凝胶化学发光成像系统，中国天能公司；PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司；水平电泳仪，南京庚辰科学仪器有限公司。

1.3 主要试剂

2×Taq PCR Master Mix预混酶、Marker DL5000、Marker DL2000均购于生工生物工程（上海）股份有限公司；Agarose琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液和Gel RED核酸染料购于北京擎科生物科技有限公司；TE缓冲液（pH值8.0）、；PBS缓冲液（pH值7.4）、MRS液体培养基均购于成都欣亿维有限公司；DP302型细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 模板筛选

1.4.1.1 模板提取方法比对

从-20 ℃冰箱中取出保藏菌株，以1%的接种量接种于1 mL的MRS液体培养基，放入37 ℃恒温培养箱静置培养16 h。选用试剂盒法和微波提取法两种方法提取基因组DNA，试剂盒提取方法按说明书操作步骤进行，微波法提取DNA具体操作为：取细菌培养液1 mL，10000 r/min离心2 min，弃去上清液，用1 mL PBS溶液洗涤两次、1 mL 1xTE溶液洗涤一次，用200 μL 1xTE溶液重悬，功率700 W的微波炉预热1 min后，加热2 min，13000 r/min离心5 min，收集上清液即为DNA。用超微量核酸蛋白测定仪测定2种提取方法获得的基因组DNA OD260/OD280值和DNA的浓度，并电泳检测基因组DNA条带及RAPD条带比较。

1.4.1.2 储存时间对模板的影响

提取模板于-20 ℃分别存放0、30、50、60、70、80、90 d，电泳检测基因组DNA的条带及RAPD分型条带，选取条带清晰且重复性好的时间，作为模板保存时间。

1.4.2 单引物筛选

以基因组DNA为模板，选择8条随机引物，对模板DNA进行单引物扩增，选取条带清晰且条带较多的引物，用于后续试验。引物序列信息如表1所示。

表1 RAPD分型随机引物序列信息Table 1 Oligonucleotide primers used to perform PCR reactions

1.4.3 RAPD双引物反应体系的优化

参考刘刚[26]的多条引物扩增条件以及扩增体系略加修改，以屎肠球菌999为模板，随机选用Primer1+Primer5引物分别对引物添加量、模板添加量进行优化。

1.4.3.1 引物添加量筛选

引物添加量梯度设置为：0.1、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 μL。

1.4.3.2 模板添加量筛选

模板添加量梯度设置：0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 μL。

1.4.4 双引物筛选

1.4.4.1 初筛

将筛选到的多态性良好的单一随机引物，进行两两组合。在筛选得到的RAPD反应条件下，选择B13、1003、999、1056、15、130、178、39、1019、1021作为模板DNA，进行RAPD-PCR扩增，筛选出特异性、稳定性高的双引物组合。PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，120 V，30 min，凝胶成像系统观察后拍照留存。每个实验重复3次。

1.4.4.2 复筛

在筛选得到的RAPD反应条件下，用初筛得到的6对双引物对32个肠球菌菌株DNA模板进行种间RAPD分型研究。

1.4.5 重复性实验

1.4.5.1 扩增批次内重复性实验

每个样品在同个PCR仪上进行3个RAPD-PCR平行实验，通过比较电泳图谱判定RAPD-PCR的重复性。

1.4.5.2 扩增批次间重复性实验

每个样品，在同个RCR仪上分批扩增3次，比较电泳图谱判定扩增批次间实验的重复性。

1.4.6 RAPD在肠球菌分型中的应用和验证

1.4.6.1 RAPD分型

在筛选的RAPD反应条件下，用1.4.4筛选出的最适RAPD双引物对24株已知肠球菌和46株未知肠球菌进行RAPD分型鉴定。

1.4.6.2 管家基因验证

使用rpoA基因序列分析RAPD分型中各个类别的代表菌株。

PCR反应体系：基因组DNA 1 μL，2×Taq Master Mix预混酶12.5 μL，正反引物各1 μL，无菌双蒸水9.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min，（95 ℃变性1 min，48 ℃退火1 min 15 s，72 ℃延伸1 min 15 s）3次循环，（95 ℃变性35 s，46 ℃退火1 min 15 s，72 ℃延伸1 min 15 s）30次循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存备用。取5 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物大小。对合格产物进行序列测定。使用NCBI网站BLAST进行在线比对，比对结果＞97%鉴定为同一菌种[27]。

1.4.7 数据统计分析

使用Gel RED核酸染料胶染法制胶，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离扩增产物。取5 μL扩增产物点样于凝胶孔，电泳缓冲液为1×TAE，120 V恒压电泳30 min后通过凝胶成像系统拍照。对RAPD标记进行处理，并按显性标记计数，将电泳图上清晰的条带标记为“1”，而在同一位置没有或不易区分的条带标记为“0”，并构建原始数据矩阵，用NTsys进行聚类分析，构建各菌株的遗传距离聚类图。

2 结果与讨论

2.1 模板筛选

2.1.1 模板提取方法的筛选

经微量核酸检测仪检测，试剂盒法提取的DNA的OD260/280为1.8～2.0，DNA质量浓度为123～353 μg/mL微波法所得到的DNA的OD260/280为1.9～2.1，DNA质量浓度为106～308 μg/mL。从数据上，虽然试剂盒提取法较微波提取法好，但是微波提取法较为方便快捷，适合大规模提取，且RAPD分型效果与试剂盒结果无明显差异，因此选择使用微波法用于模板提取。

2.1.2 DNA模板稳定性

模板稳定性影响RAPD分型结果，研究结果显示微波法提取的DNA模板在-20 ℃条件下90 d保存期间内扩增出的RAPD图谱无明显变化，说明经由微波法提取的DNA模板在-20 ℃条件下在90 d内均可用于RAPD-PCR分型研究。

2.2 单引物筛选结果

如图1所示，屎肠球菌999的在8条随机引物扩增下Primer 1～7均可获得多态性条带（泳道1～7），而Primer 8没有扩增出条带。因此选用Primer 1～7作为后续双引物筛选试验的引物。

图1 不同单引物的RAPD-PCR扩增电泳图Fig.1 RAPD-PCR amplification by different single primer

2.3 RAPD双引物反应体系的优化

2.3.1 最适引物添加量

如图2所示，引物添加量在0.1～1 μL范围内，随着引物添加量的增加，扩增结果条带的数量和亮度均有增加，即引物添加量影响扩增带型的多态性，当引物添加量大于1 μL时，无特异性条带增加，故确定最适的引物添加量是1 μL。

图2 不同引物添加量对菌株999的RAPD扩增图谱Fig.2 Influence of primer additive volume on RAPD profiles of strains 999

2.3.2 最适模板DNA添加量

由图3所示，不同模板DNA添加量对反应影响显著，在0.5～1 μL范围内，随着添加量的增加，带型丰度增加，模板DNA在添加量为1 μL时扩增的谱带最为清晰，多态性较好；当引物添加量高于1 μL时，扩增的出的500 bp以下的3条带亮度减弱，并出现背景弥散。这是因为本试验提取的DNA没有经过纯化，添加量过多时会抑制RAPD-PCR的进行，故确定最适的模板DNA添加量是1 μL。

图3 不同DNA添加量对菌株999的RAPD扩增图谱Fig.3 Influence of DNA additive volume on RAPD profiles of strains 999

综上所述，经过单因素试验确定最适反应体系为：2×PCR Taq Mix12.5 μL，模板DNA1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。

2.4 双引物筛选结果

将7个单引物随机两两组合获得21种组合方式，在RAPD反应条件下分别使用21对双引物对10株肠球菌DNA模板进行RAPD扩增，如图4所示，筛选得到了6对多态性好、稳定性高的双引物组合，即Primer 1+Primer 2、Primer 1+Primer 3、Primer 1+Primer 5、Primer 2+Primer 4、Primer 3+Primer 4、Primer 3+Primer 5。

图4 不同双引物对菌株999的RAPD-PCR扩增电泳图Fig.4 RAPD-PCR amplification of strain 999 by different double primers

在相同条件下，分别使用6对双引物对已知32株肠球菌进行RAPD-PCR扩增，结果显示使用Primer 1+Primer 3、Primer 1+Primer 5和Primer 2+Primer 4组合均可获得丰富的多态性带型，可扩增出2～5个条带；而Primer 1+Primer 2、Primer 3+Primer 5进行RAPD-PCR时均有部分样品没有扩增出条带，Primer 3+Primer 4进行RAPD-PCR时屎肠球菌（1096）与耐久肠球菌（130、15、426、1029、127、178、1451）无法分开，相似度100%。

目前应用RAPD技术对乳酸菌属间分型研究中，是在75%～88%的相似度下做到属间分型[7,22]，目前未见RAPD技术对肠球菌种间的相似度分型标准，三种组合均能明显找出各种间的差异，分别在86%、80%、86%的相似度下将肠球菌在种间区分。其中，从区分度来看，Primer 1+Primer 5组合分辨力最高，可作为肠球菌种间分型的最佳双引物对。

Primer 1+Primer 3组合RAPD-PCR扩增时发现在500 bp位置出现海氏肠球菌的特征条带，可以作为海氏肠球菌的鉴定指标，由图5所示。研究发现，海氏肠球菌是一种低感染性的肠球菌[28]，已被国家微生物资源平台收录并定义为一种潜在的益生菌。有研究者从山羊奶中分离出一株具有抑菌性、耐高温、耐酸碱，对常见抗生素敏感，无毒力基因的海氏肠球菌，经选择培养基初筛后，进行细菌的分离纯化，并采用形态学、生化试验及16S rDNA基因扩增测序对分离菌株进行鉴定，最后鉴定结果为海氏肠球菌[29]，鉴定方法较为繁琐，本试验发现在Primer 1+Primer 3组合进行RAPD-PCR扩增时发现500 bp位置的条带是海氏肠球菌的特征条带，可以作为海氏肠球菌的鉴定指标。

图5 Primer 1+Primer 3引物扩增32株肠球菌指纹图谱Fig.5 Finger print of 32 Enterococcus was amplified with Primer 1+Primer 3

2.5 重复性实验

使用Primer 1+Primer 5对10个基因组DNA进行扩增，结果如图6、7，显示在批次内及批次间，获得的样品多态性图谱结果一致，说明在优化后的体系条件下，具有较高的重复性及稳定性。

图6 RAPD扩增批次内重复性试验Fig.6 RAPD patterns of repeat test in a batch

图7 RAPD扩增批次间重复性试验Fig.7 RAPD patterns of repeat test among a batch

2.6 RAPD在肠球菌分型中的应用和验证

用Primer 1+Primer 5组合对24株已知肠球菌和46株未知分离株基因组DNA进行RAPD扩增。由图8可知，46株未知肠球菌和24株已知肠球菌在80%的相似度下，可以分为13个亚型。除401、461、472单独聚在亚型11，其他43株未知菌株均与已知菌株聚类，分别是33株屎肠球菌、8株耐久肠球菌、2株海氏肠球菌；将所有菌株进行管家基因rpoA基因序列分析，43株未知菌株的rpoA结果和RAPD结果一致，401、461、472均为耐久肠球菌，说明RAPD应用于肠球菌鉴定结果具有可靠性。

图8 Primer1+Primer5引物扩增70株肠球菌的聚类树状图Fig.8 Clustering tree of 70 Enterococcus was amplified with Primer1+Primer5

3 结论

本研究以分离自传统自然发酵食品中的肠球菌为研究对象，从优化RAPD体系入手，并应用RAPD技术来对肠球菌分型。首先，高质量的DNA是进行PCR、基因克隆、测序和指纹图谱等分子生物学方法的基础，采用试剂盒法和微波法提取肠球菌DNA，筛选出微波法为后续实验的提取方法；其次，研究表明，退火温度、PCR Taq Mix酶的添加量、引物添加量、模板添加量均会影响扩增效果。本试验通过对RAPD反应条件中引物添加量、DNA模板添加量的优化，确定RAPD最适反应体系为：2×PCR Taq Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；最后，RAPD-PCR存在的主要问题是很难在实验室内和实验室之间得到重复性试验结果。本试验结果表明，在保证模板样品、在同一台PCR仪的前提下，无论是批次内验证实验还是批次间验证实验，获得的样品多态性图谱结果一致，故说明在最适的反应体系条件下，实验具有很高的重复性及稳定性。

本试验通过引物的预筛选，得到3对多态性好、稳定性高的引物组合，即Primer 1+Primer 3、Primer 1+Primer 5和Primer 2+Primer 4组合。三种组合都可获得稳定性高的多态性带型，分别在86%、80%、86%的相似度下将肠球菌在种水平上分型。Primer 1+Primer 5组合的分辨率最高，因此推荐应用在肠球菌种间的分型中。此外，在Primer 1+Primer 3组合进行RAPD-PCR扩增时发现500 bp位置的条带是海氏肠球菌的特征条带，可以作为海氏肠球菌的鉴定指标。

通过RAPD和rpoA基因序列分析对肠球菌分离株进行鉴定，发现RAPD结果和rpoA鉴定结果一致，说明肠球菌RAPD分型结果具有可靠性。综合比较结果考虑，RAPD技术在肠球菌分类鉴定中有一定的应用价值，同时它有操作简单快速、属间和种间区分效率高、费用低的优势，与其他表型和基因型方法相结合，可提高菌种鉴定效率和准确性。