通过MAPK/ERK1/2信号通路探讨固本增骨方对MC3T3-E1成骨分化的影响

宋敏 李凯 王凯 范凯 海云翔 李金益 刘路

1.甘肃中医药大学中医临床学院,甘肃 兰州 730000 2.甘肃省中心医院急诊科,甘肃 兰州 730050

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨转化增多、骨量降低为特点的慢性骨病,病程发展上伴有骨微结构破坏及骨强度降低等病理改变,导致发生骨折的危险性增加[1]。随着我国社会人口老龄化的加剧,OP的防治已成为我国面临的重要公共健康问题。

甘肃省名中医宋敏教授擅长运用中医药防治骨伤科相关疾患,宋教授依据“脾肾亏虚-气虚血瘀-髓空骨枯”核心病理机制,结合多年临床经验总结,从整体观念、辨证论治理念出发,以益气健脾、补肾壮骨、活血止痛治则,研发出固本增骨方,在长期临床治疗中疗效显著且具安全性高,前期临床研究显示固本增骨方能明显增加OP患者的骨密度,并通过动物实验证实其具有雌激素样作用,可改善卵巢切除OP大鼠雌激素低下状态,调节骨代谢紊乱,预防骨量丢失[2]。

本研究在团队前期研究基础上,通过体外培养MC3T3-E1细胞,观察固本增骨方含药血清对成骨细胞增殖分化及矿化的影响并探讨其潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物与细胞:SPF级SD大鼠30只,雌雄各半,6周龄,体重为(200±20)g,由甘肃中医药大学动物实验中心提供,实验动物使用许可证号:SYXK(甘)2020-0009。MC3T3-E1细胞株由赛百慷(上海)生物技术股份有限公司提供(货号:icell-m031),本实验通过甘肃中医药大学实验中心动物伦理委员会审查批准(文件批号2021-061)。

1.1.2药物与试剂:固本增骨方药物组成:当归12 g、炙黄芪30 g、熟地黄12 g、烫狗脊12 g、乌药9 g、党参12 g、淫羊藿9 g、补骨脂9 g、肉苁蓉9 g、鹿角胶3 g、土鳖虫9 g。由甘肃中医药大学附属医院中药药剂科提供,制成药粉后配成1.13 g/mL混悬液。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(上海咏科生物科技有限公司,批号AS1012);磷酸化蛋白酶抑制剂(赛默飞世尔科技中国有限公司,批号AS1008);茜素红染液(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号G1038);PD0325901(默克生命科学技术有限公司,批号EP013)。

1.1.3主要实验仪器:酶标检测仪(Diatek,DR-200Bs)转移电泳仪槽(北京市六一仪器厂,SCO6WE);台式离心机(上海安亭科学仪器厂,TGL-16c);电泳仪(北京市六一仪器厂,DYY-6C);荧光定量PCR仪(Life technologies,QuantStudio 6)。

1.2 方法

1.2.1固本增骨方含药血清的制备:30只大鼠按照随机数字表法分为含药血清组(20只)和空白血清组(10只),固本增骨方制成浓度为1.13 g/mL的混悬液,按照体表面积法换算(10 mL/kg药液)后对含药血清组大鼠按2.26 g/kg进行灌胃,空白血清组用等体积生理盐水灌胃,每日两次,每次2 mL,连续灌胃7 d,最后一次给药2 h后,用2%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉,心脏穿刺采血。

1.2.2细胞培养:MC3T3-E1细胞经复苏,培养后重悬,将适宜密度细胞接种分瓶后在条件适宜的培养箱中传代培养。

1.2.3CCK-8检测细胞增殖活性:取消化重悬的MC3T3-E1细胞,以1.5×105个/mL接种于96孔板,共设立6组,每孔加100 μL,每组平行设置6个复孔,分为空白血清组、5%、10%、15%、20%、25%各含药血清组,空白血清组加入空白血清培养基200 μL,其余各组加入200 μL含有相应浓度固本增骨方含药血清的培养基。在对应24、48、72 h干预时间点向每孔加入10 μL CCK-8溶液,培养箱中孵育2 h,酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。

1.2.4细胞ALP活性检测:将MC3T3-E1细胞制成单细胞悬液,以1.5×105个/mL密度接种细胞,按上述分组加入相应培养基,每3 d换液1次,诱导7 d后收集各组细胞培养液,2000g×10 min离心,去不溶物,取上清作为样品进行ALP活力检测,酶标仪检测波长设置为520 nm。

1.2.5茜素红染色:选取MC3T3-E1细胞,以2×105个/孔的密度于6孔板,细胞分组同上,根据各组条件干预培养14 d后进行茜素红染色。具体步骤为吸去各组相应培养基,用PBS冲洗3次,每次5 min,加入2 mL 4%多聚甲醛固定20 min,再用PBS冲洗3次,每次5 min,加入茜素红染液,染色5～10 min,PBS冲洗3次。在倒置显微镜下观察茜素红染色效果并拍照存档。

1.2.6RT-PCR检测ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表达:根据CCK-8、ALP活性检测及茜素红染色结果综合分析,将MC3T3-E1细胞分为A、B、C、D 4组。A组:空白血清组,B组:20%含药血清组,C组:空白血清+PD0325901组,D组:20%含药血清+PD0325901组,各组加入相应血清及PD0325901继续培养14 d,采用trizol法提取总RNA,核酸蛋白仪检测总RNA的浓度及纯度,按照说明书逆转录步骤得到cDNA。设计引物及反应体系。后在RT-PCR仪上进行反应后检测目的基因CT值。

1.2.7Western blot检测ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表达:4组细胞按相应条件干预培养36 h后弃掉培养基,用PBS冲洗后每孔加入裂解液,置于冰上裂解细胞30 min后提取细胞总蛋白,蛋白变性后,采用BCA法进行蛋白定量,后进行电泳、转膜及封闭,先后加入一抗和二抗,将配置好发光液,均匀滴加发光液于膜中,显影,成像,分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析法,组间两两比较采用LSD法,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 固本增骨方含药血清对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响

CCK-8实验结果显示,与空白对照组相比,10%、15%、20%、25%含药血清组在24、48、72 h时的OD值差异具有统计学意义(P<0.05),且以20%含药血清组在48 h时间点的OD值最高。干预至48 h后,细胞增殖呈下降趋势,48 h时间点MC3T3-E1细胞增殖活性与24、72 h各时间点进行比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度固本增骨方含药血清对各组细胞增殖的影响

2.2 固本增骨方含药血清对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响

与空白对照组相比,10%、15%、20%、25%含药血清组ALP活性明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与各含药血清组相比,20%含药血清组ALP活性升高更加显著,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组MC3T3-E1细胞干预7 d后细胞ALP的活性比较

2.3 固本增骨方含药血清对MC3T3-E1细胞成骨矿化的影响

药物干预14 d后茜素红染色,镜下观察可见,与空白对照组组间对比,各含药血清组(10%、15%、20%、25%)红色钙结节数量明显更为密集,5%含药血清组红色钙结节数量无明显差异,其中20%含药血清组红色钙结节密集程度最为显著,当浓度增加到25%时,钙结节密集程度略呈下降趋势,见图1。

图1 各组MC3T3-E1细胞茜素红染色结果(×200)

2.4 各组细胞ERK1/2、Runx2、BMP-2的mRNA表达

与A组相比,B组ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA的表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);使用抑制剂后,相比于A组、B组,C组及D组上述目的基因表达水平明显降低(P<0.05),与D组相比,C组的下降趋势更为显著(P<0.05)。见表3。

表3 各组MC3T3-E1细胞中ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表达量

2.5 各组细胞ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2的蛋白表达

与A组相比,B组ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表达水平明显升高,差异显著(P<0.05)。相比D组,B组ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2表达水平升高(P<0.05)。A组与C组相比,结果无明显差异(P>0.05)。与D组相比,C组ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2表达水平较低(P<0.05)。见图2、表4。

图2 各组细胞目的蛋白P-ERK1/2、ERK1/2、Runx2、BMP-2的表达量

表4 各组细胞目的蛋白ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2的表达量

3 讨论

骨质疏松症作为一种系统代谢性疾病,在病程发展及转归预后上严重影响老年人的生活质量[3]。中医学将OP归属为“骨痿”范畴[4],《素问·痿论》曰:“肾气热,则腰膝不举,骨枯而髓减,发为骨痿”,原文首次阐明了“肾气热”是OP发生的致病因素,“髓减骨枯”是OP发展的核心病机。又有《脾胃论·脾胃胜衰论》曰:“脾病则下流乘肾……是为骨蚀”,将脾病亦作为OP发生发展的重要环节[5]。由此可见,脾虚乏源损及肾,脾肾不足,则骨削肉减,发为骨痿。OP为老年慢性骨病,发病缓慢,病程较久,久病则生瘀滞,正如《灵枢·营卫生会》云:“老者之气血衰,其肌肉枯,气道涩[6]。”因此,气虚血瘀是OP发生发展的关键促进因素。由上述可知,OP的发生发展是多因素共同作用的结果,而中医药防治疾病立足于“整体观念、辨证论治”体系,具有多途径、多靶点、多层面等突出特点,在OP的防治中可发挥其综合治疗优势。固本增骨方由黄芪、党参、熟地黄、淫羊藿、肉苁蓉、当归等药组成,全方温、补、通、调并用,共奏补肾壮骨、益气健脾、活血止痛之效,能够有效增加患者骨密度,同时改善其临床症状,具有良好的临床疗效。前期网络药理学研究提示[7],固本增骨方发挥抗OP作用与多种入血活性分子的交感、联合效应有关,这一过程涉及多条信号通路的调控。

MAPK作为一类介导细胞反应的蛋白激酶家族广泛存在于真核生物细胞内,活化的MAPK参与细胞增殖、分化、应激及炎症反应等过程[8]。ERK1/2是MAPK通路的主要亚型之一,其通过依次激活MAPKKK-MAPKK-MAPK三级激酶模式实现信号由细胞膜外向核内的传递,活化的MAPK/ERK1/2通路广泛参与调控成骨细胞的增殖与分化,从而发挥防治OP的作用[9]。研究发现,淫羊藿苷可通过调控MAPK/ERK1/2的磷酸化抑制OC分化,从而达到防治OP的作用[10]。陈锦成等[11]研究发现,龟鹿二仙胶含药血清可通过激活MAPK/ERK1/2通路及该通路下游靶蛋白E26转录因子1促进大鼠BMSCs成骨分化。丁道芳等[12]研究了不同浓度大鼠含药血清对成骨细胞增殖的影响,发现激活MAPK-ERK1/2通路可提高成骨基因Ⅰ型胶原、Runx2和ALP的表达水平,有助于提高成骨细胞的增殖活性。

本研究结果显示,固本增骨方对MC3T3-E1细胞增殖活性具有促进作用,其中,20%含药血清干预48 h对MC3T3-E1细胞的增殖作用最为显著,当含药血清浓度增加到25%时,MC3T3-E1细胞生长速度呈现下降趋势,这可能与细胞间接触性抑制作用有关。ALP活性检测与茜素红染色实验也印证了这一结果,检测各组培养液中ALP活性表达水平,结果表明,在一定含药血清浓度范围(10%～20%),ALP活性增长呈现浓度依赖性,其中,以20%含药血清组ALP活性最为显著。当浓度增加到25%时,ALP活性降低。茜素红染色后,20%含药血清组钙结节数量最为密集。为了验证固本增骨方促MC3T3-E1细胞成骨分化作用与MAPK/ERK1/2信号通路的关系,进一步检测了MAPK/ERK1/2信号通路相关蛋白基因。WB及RT-PCR结果表明,与空白对照组相比,固本增骨方含药血清能够显著上调P-ERK1/2、ERK1/2、BMP-2、Runx2蛋白及ERK1/2、BMP-2、Runx2 mRNA的表达水平。加入PD0325901通路抑制剂后,空白血清组与含药血清组中目的蛋白及mRNA表达均下调,但含药血清组目的蛋白及mRNA的表达水平仍高于空白血清组,表明固本增骨方含药血清具有促进MC3T3-E1细胞的成骨分化的作用,其作用机制可能与激活MAPK/ERK1/2信号通路,上调成骨相关因子Runx2、BMP-2有关。然而,由于中药复方具有多层面、多途径的综合治疗机理,当前对固本增骨方防治OP的研究仍处于中药复方的整体调控作用,其中发挥作用的具体有效成分及潜在分子靶点尚不明确。此外,研究发现除ERK1/2通路外,p38与JNK通路同样作为MAPK的主要亚型对于骨稳态的调控也具有一定作用[13-14],而对于ERK1/2与JNK及p38各通路之间是否存在交互调控作用尚不清楚,有待进一步研究。