CircRNA作为骨质疏松症生物标志物的研究进展

彭晨健 孙海涛 王军 魏伟 刘岸龙 储旭东 钱卫庆 马勇, 郭杨 王礼宁*

1.南京中医药大学附属南京中医院骨伤科,江苏 南京 210022 2.无锡市惠山区人民医院骨科,江苏 无锡 214100 3.南京中医药大学附属医院骨伤科,江苏 南京 210001 4.南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室,江苏 南京 210023 5.南京中医药大学中医学院·中西医结合学院,江苏 南京 210022

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种老年人尤其是绝经后妇女常见的全身性代谢障碍性骨病,以骨组织微观结构退化、单位体积骨量减少、骨脆性增加为特征[1-2]。随着人口老龄化的加快,骨质疏松症的发病率也越来越高,大多患者在发生骨质疏松性骨折后才获得明确诊断,从而使得骨质疏松症的诊断存在不同程度地滞后性,成为严重危害健康的公共卫生问题,给患者和社会带来了沉重的负担[3-4]。

目前临床上对骨质疏松症的诊断主要通过骨密度检测(bone mineral density,BMD)来实现,但是骨密度变化缓慢具有一定的局限性和滞后性。骨代谢相关生化指标可反映骨代谢状态,并作为协助诊断和鉴别诊断指标,但在疾病发展早期的敏感性仍显不足。因此,积极发现并探索潜在的OP早期诊断相关生物标志物,提前干预防止骨质疏松症严重并发症的发生,具有重要的临床价值及社会意义。

环状RNA(circRNA)是一组非编码RNA,具有较强的稳定性和组织特异性,在细胞功能中起着重要作用。随着人们对表观遗传学研究的深入,大量研究证明了circRNA通过多种途径参与调控成骨细胞和破骨细胞分化及功能,从而影响骨形成和骨吸收,与骨质疏松症发生发展密切相关,具有作为潜在临床生物标志物的潜能[5-6]。

综上,本文拟通过文献综述circRNA在骨代谢中的作用,以及circRNA作为生物标志物在骨质疏松症早期诊断中的研究进展。

1 骨质疏松症的生物标志物

生物标志物是指能被客观测量和评价,反映生理或病理过程,以及对暴露或治疗干预措施产生生物学效应的指标。生物标志物不仅可从分子水平探讨发病机制,而且在准确、敏感地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势,可提供早期预警,很大程度上为临床医生提供了辅助诊断的依据。

临床技术发展至今,仍是以骨密度作为诊断骨质疏松症、预测骨质疏松性骨折发生风险、评估抗骨质疏松药物治疗效果的主要指标。但由于骨密度需凭借双能DXA仪器进行测量,变化过程缓慢,不能反映短期内骨质的变化情况,常需结合骨代谢指标进行动态监测观察[7]。在OP的诊断过程中不同的生物标志物均发挥着相应的作用,骨代谢的动态情况可通过骨代谢生物标志物反映,而circRNA被研究发现在OP早期诊断中发挥着潜在作用。

骨形成和骨吸收是骨代谢的基本活动,骨形成与骨吸收的动态平衡是维持骨量和骨稳定性的基础[8]。成骨细胞在骨形成过程中起着关键作用,骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,B-ALP)、骨钙素(osteocalcin,OC)可反映成骨细胞的活性从而直接反映骨形成的状态。同时成骨细胞所合成的I型原胶原可分解释放Ⅰ型原胶原N末端前肽(procollagen type I amino-terminal propeptide,PINP)和Ⅰ型原胶原C末端前肽(procollagen type I carboxy-terminal propeptide,PICP)也可作为反映骨形成状态的生物标志物。骨硬化蛋白(sclerostin) 作为成骨细胞的特异性表达蛋白可作为调控骨形成的生物标志物。骨保护素(osteoprotegerin,OPG)可抑制破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞分化,从而减少骨吸收增加骨形成,是一种新型骨形成标志物。

骨吸收的代谢产物和体现破骨细胞活性的物质通常被用来作为骨吸收的生物标志物。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrated resistant acid phosphatse,TRAP)、Ⅰ型胶原交联C-末端肽( cross linked C-telopetide of collagen type I,CTX)、Ⅰ型胶原交联 N-末端肽( cross linked N-telopetide of collagen type I,NTX)、吡啶啉(pyridinoline,PYD)和脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)与破骨细胞活性成相关,可作为反映骨吸收状态的生物标志物。羟脯氨酸(hydroxyproline,HOP)和组织蛋白酶K(cathepsin,Cat K)作为骨吸收的代谢产物也可作为骨吸收的生物标志物,但HOP可来源于皮肤等其他组织,故缺乏特异性。现有的这些骨代谢生物标志物(表1)多为骨代谢的生化产物,可从体液中检出,具有安全、便捷、快速、经济的特征,但这些骨代谢生物标志物一般只能从单一角度反映骨代谢的现状,仅可用于骨平衡情况的监测,并不能直接用于骨质疏松症的诊断[9]。因此寻找更具特异性和灵敏度的生物标志物,在骨质疏松症早期诊断上发挥更大作用是今后的研究重点。

表1 骨形成与吸收的骨代谢生物标志物

2 circRNA作为骨质疏松症生物标志物

circRNA作为一种具有稳定环状结构的ncRNA,稳定存在于血液及各类体液中,可在基因层面调控骨质疏松症的发生发展,因此其具备了成为骨质疏松症早期诊断生物标志物的潜能[10]。

2.1 circRNA的生物学特性及功能

作为目前非编码RNA领域研究的热点,circRNA可在多种生物体中表达,具有稳定的环状结构,可防止外切核酸酶介导进行降解,使其成为疾病中特殊的分子标记物[11-13]。研究表明,circRNA可通过不同的机制在疾病的发生、发展及演变过程中发挥重要的调控作用[14-17]。目前已有大量相关研究发现circRNA在神经系统疾病、心血管疾病、肿瘤疾病的发生发展和治疗中起着重要作用,可作为疾病诊断及判断预后重要的生物标志物,也可作为治疗的分子靶标,具有非常重要的研究意义及临床应用价值[18-20]。

2.2 circRNA调节成骨细胞与骨形成

成骨细胞作为骨形成过程中的重要细胞,可通过骨矿化、分泌生物活性因子及参与骨基质合成等多方面调控骨形成过程。对于成骨细胞分化活动,Qian等[21]通过使用RNA测序技术检测BMP-2诱导鼠成骨细胞分化过程中circRNA的差异性表达发现,circ_19142、circ_5846 和circ_10042在高分化的成骨细胞中表达水平显著升高。并通过实验发现BMP2通过circ_19142/circ_5846 靶向 miRNA-mRNA 轴诱导MC3T3-E1细胞成骨分化。而Huang等[22]在研究YAP1促进BMSCs和MC3T3-E1的成骨分化的机制中发现,circ_0024097可通过miR-376b-3p/YAP1轴和Wnt/β-catenin通路促进BMSCs和MC3T3-E1成骨分化以促进骨形成。对于成骨分化相关生长因子方面的研究,骨桥蛋白( osteopontin,OPN)和胶原蛋白α-1(COL15A1)可调节 MC3T3-E1和MDPC23细胞的分化和矿化,而经验证这一过程是circ_003795通过miR-1249-5p/COL15A1轴实现的[23]。也有实验研究表明,沉默circ_ 009056可以增加miR-22-3p的表达,并降低BMP7、Runx2 的表达水平[24]。因此circ_009056可作为miR-22-3p的海绵,调节降钙素基因相关肽诱导的细胞成骨过程。关于circ_0062582国内学者研究有着不同的研究发现,Li等[25]研究得出circ_0062582可通过靶向miR-145/CBFB轴来促进BMSCs的成骨分化,并上调OSX、OCN和COL1等成骨分化相关蛋白的水平;而Chen等[26]则研究发现circ_0062582也可通过海绵化miR-197-3p上调Smad5的表达,从而促进BMSCs增殖和成骨分化。通过不同方法对不同种类的成骨细胞进行研究分析发现,circRNA可反映成骨细胞在不同骨形成阶段对于分化、增殖等多方面的调控作用。

2.3 circRNA调节破骨细胞与骨吸收

随着人们对circRNA研究不断的深入,越来越多的研究表明circRNA通过不同机制参与破骨细胞的成熟、分化、凋亡等过程。关于破骨细胞的增殖,Miao等[27]发现circRNA_009934作为miR-5107的ceRNA,调节其下游TRAF6靶基因的表达,促进破骨细胞的生成。在破骨细胞的分化研究中,Chen等[28]通过微阵列分析发现骨髓单核细胞巨噬细胞 (BMM) 分化中circ_28313的差异化表达,同时生物信息学分析表明circ_28313、miR-195a和CSF1形成一个ceRNA网络,circ_28313通过miR-195a 间接调控靶基因CSF1的表达,从而调节BMM细胞向破骨细胞分化。而Liu等[29]通过生物信息学分析和荧光素酶报告揭示了circ_Hmbox1/miR-1247-5p/Bcl6的相互作用的机制。circ_Hmbox1主要通过与miR-1247-5p结合来抑制RANKL诱导的破骨细胞分化,miR-1247-5p可靶向bcl6调控破骨细胞分化和成骨细胞分化,以参与骨代谢的调节。也有学者通过分析绝经后骨质疏松症患者中不同表达水平的circRNA发现circ_0007059在骨质疏松症患者和人骨髓基质细胞破骨分化过程中表达上调。进一步研究发现circ_0007059可通过miR-378/BMP-2轴在破骨细胞形成中发挥重要作用,circ_0007059过表达可抑制BMSCs向破骨细胞的分化[30]。

3 circRNA与骨质疏松症的早期诊断

目前,骨质疏松症的诊断仍是以骨密度作为主要指标,但由于其检测具有局限性及不便性,往往不能对骨质疏松症进行早期诊断。circRNA可稳定并广泛存在于人体的体液、血液及其他组织标本中,且在不同时期、不同组织的表达水平不同,具有时序性和组织特异性,使得circRNA成为现阶段研究的热点[31]。大量临床及实验研究证实circRNA在骨质疏松症患者的外周血、骨髓干细胞或骨组织中表达均存在显著差异,因而circRNA具备作为早期诊断生物标志物的潜能。

3.1 血清及血浆中的circRNA

血清及血浆作为血液的重要组成部分,含有多种蛋白质、脂类物质、维生素、无机物、核酸衍生物等分子成分,作为常用的临床检验检测标本,具有获取简便、质量稳定等特点,近年来也广泛用于circRNA的研究。Yao等[32]对20例合并有椎体压缩性骨折的骨质疏松症患者的血清进行circRNA测序,共检测出884个差异表达的 circRNA,其中上调554个,下调330个。Huang等[33]通过芯片技术研究发现circ_0006873和circ_0002060在老年性骨质疏松症患者的血清表达中显著升高,且circ_0006873和circ_0002060的表达量与BMD和T值呈显著相关。ROC曲线显示circ_0002060(AUC=0.746,P<0.05,灵敏度78%,特异性69%)对骨质疏松症具有潜在的诊断价值,具有进一步开发作为骨质疏松症生物标志物的作用。Han等[34]研究发现circ_0076690作为骨质疏松症的诊断价值(ROC曲线显示AUC = 0.829 9,P< 0.001,灵敏度为 79%,特异性为 85%)后,通过生物信息学分析和实验验证进一步发现circ_0076690可通过海绵化miR-152靶向Runx2以调节BMSCs的成骨分化,因此认为circ_0076690可以通过调节成骨分化影响骨代谢,从而作为骨质疏松症诊断的潜在生物标志物。

3.2 外周血单核细胞中的circRNA

外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作为破骨细胞前体细胞可以被诱导分化为破骨样细胞,这使得外周血单核细胞与骨质疏松症关系密切,且外周血循环中单核细胞的RNA表达稳定,具备成为生物标志物的良好潜力。Guan等[35]从外周血单核细胞中探究潜在的生物标志物,通过芯片测序及qPCR验证发现circ_0021739在绝经后骨质疏松症患者外周血单核细胞中表达显著升高,ROC分析提示(AUC=0.849,P<0.001,灵敏度100%,特异性42.9%)circ_0021739具有作为PMOP诊断生物标志物的潜能。进一步研究发现circ_0021739可靶向miR-502-5p以调控破骨细胞生成,为开发骨质疏松症的早期预防和诊断方法提供了新的途径。Zhao等[36]用同样的方法对58例绝经后骨质疏松症患者及41例绝经后老年健康对照组志愿者的外周血单核细胞进行研究发现,circ_0001275存在差异性表达,其表达量与T值呈负相关,ROC曲线显示circ_0001275具有显著的诊断价值(AUC=0.759,P<0.001),所以circ_0001275可作为绝经后骨质疏松症的潜在生物标志物。

3.3 血清外泌体中的circRNA

外泌体(eosomes)是直径在30～150 nm的盘状囊泡,携带有大量生物学信息如蛋白质、核酸及转录因子等,在进入靶细胞后可以对细胞发挥调节作用。此外,外泌体的脂质双层可以保护RNAs不被核糖核酸酶降解,从而保留它们的功能活性,有利于标志物样本的采集和储存。Zhi等[37]在对以血清外泌体为检测标本的一项对照研究中发现,骨质疏松症患者外泌体中的circ_0006859上调,ROC曲线分析表明,circ_0006859可将骨质疏松症患者与健康对照组区分开(AUC=0.897 4,P< 0.000 1,灵敏度93.1%,特异性93.33%),进一步生物信息学和实验探究发现circ_0006859可通过海绵化miR-431-5p上调ROCK1抑制骨生成并促进脂肪生成,导致骨质疏松症发生。且对患者进行9个月的抗骨质疏松治疗后,血清外泌体中circ_0006859的表达水平也显著下调,这进一步验证了circ_0006859作为骨质疏松症生物标志物的巨大潜力。

3.4 骨髓间充质干细胞及骨组织中的circRNA

骨髓间充质干细胞作为骨代谢过程的重要细胞,可促进骨修复和促进骨发育,与骨质疏松症的发生发展也有密切关系。骨髓间充质干细胞中的circRNA不少都可作为治疗骨质疏松症的潜在新靶点。在对骨质疏松症患者BMSCs进行研究上,Qiao等[38]发现circ_0048211的表达与miR-93-5p呈负相关,与BMP2呈正相关。circ_0048211可负向靶向miR-93-5p以上调BMP2,以减缓绝经后骨质疏松症的进展。Wen等[39]通过对骨质疏松症患者的骨组织标本进行研究发现circ_0076906通过海绵化miR-1305上调OGN的表达以促进BMSCs的成骨分化,减缓骨质疏松症的发展。Long等[40]研究发现circ_0016624可通过海绵化miR-98,增强BMP-2的表达,加强成骨诱导因子的生成从而改善骨代谢预防骨质疏松症发生。同时Liu等[41]研究证明circ_0007059可直接靶向miR-378,而miR-378又靶向BMP-2,circ_0007059过表达可抑制BMSCs向破骨细胞的分化,因而靶向circ_0007059/miR-378/BMP-2轴可能是治疗骨质疏松的新思路。Ji等[42]研究新发现circ_0006215 通过竞争性结合miRNA-942-5p可调节BMSCs中RUNX2和VEGF的表达,以促进成骨分化及血管新生。同时体内实验又通过敲低和过表达circ_0006215在皮质骨缺损模型验证了其骨修复的作用,所以circ_0006215具有成为治疗老年性骨质疏松症的新靶点的巨大潜能。见表2。

表2 不同样本中circRNA作为骨质疏松症生物标志物的机制和潜能

4 总结与展望

综上所述,众多circRNA已被证实可通过多种机制参与骨代谢的调节,并影响成骨细胞、破骨细胞及骨髓间充质干细胞的增殖、分化及凋亡,调控骨形成与骨吸收过程。circRNA由于其特殊的稳定的环状结构,且具备时空特异性和组织细胞特异性等特征,可在血清、细胞、外泌体、组织等中稳定表达,已逐渐显现出了成为骨质疏松症诊断生物标志物的出色潜能。

目前对于circRNA作为骨质疏松症生物标志物的研究,大多通过微阵列或circRNA测序技术分析筛选临床样本中差异化表达的circRNA,并与骨质疏松症临床特征相关联,通过ROC分析曲线筛选具备生物标志物潜能的候选circRNA。后续根据实验验证circRNA 作为生物标志物的可靠性和灵敏度,同时生物信息学及转录组学研究也可分析论证其在骨质疏松症发生发展中的作用机制。但就目前已有的研究报道,circRNA大多通过形成circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络引起骨代谢调控失常,从而影响骨质疏松症的疾病进展,但其精确的作用靶标往往难以寻找。相信随着生物信息学技术及基因测序技术的发展,骨质疏松症中有关circRNA作为诊断标志物的研究也将更加深入。

作为生物标志物,必须有性质稳定、重复性好、采集方便、便于重复检测动态观察其表达水平等特质。现有研究中,相同来源的不同组织样本作为研究对象往往会得出不同的研究结果。因此,样本的来源和处理、保存、测定方法便显得尤为重要。血清、外周血单核细胞及血清外泌体作为标本均具有上述优势,后续的保存加工也相对简单。如何从这几类样本中选取合适的类别作为骨质疏松症早期诊断生物标志物也是亟需关注的问题。

同时,由于现有研究的样本量往往较少,研究结论差异性较大。未来随着转录组学、基因组学、影像组学的不断发展,可以尝试进行多种生物诊断标志物的联合应用,如体液标志物和影像标志物的联合。另外可通过进行多中心大样本量的人群研究,对具有巨大生物标志物潜力的circRNA进行进一步的体内实验验证及随访观察,以实现circRNA作为诊断生物标志物在骨质疏松症中的临床应用,为骨质疏松症的早期诊断提供有效手段。