六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证的作用

阮红良 佘冬梅 孙绍裘 陈振华

湖南中医药大学第二附属医院骨伤科,湖南 长沙 410005

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一种多发于中老年女性的慢性全身代谢性疾病,起病隐匿,无特异性症状[1]。其发病机制主要是由于绝经后雌激素及褪黑激素等缺乏,致使骨代谢失衡骨量减少,骨小梁微结构破坏[2-3]。既往研究表明,20%的女性患有PMOP,其中10%的女性有不同部位的骨折,骨质疏松性骨折严重影响生活质量[4]。因此,开展PMOP临床与基础研究,早期诊断和治疗对于预防骨质疏松骨折至关重要。中医论治PMOP多属于肾阴虚证,补肾中药能较好地治疗PMOP。有文献报道,六味地黄丸能提高患者骨密度,改善临床症状。其临床疗效与绝经后肾气渐虚,肾阴阳失调,人体免疫机能失调有关[5-6]。目前六味地黄丸治疗PMOP肾阴虚证作用的分子基础尚不十分清楚,需进一步探讨。近年来研究发现,多种表观遗传和转录因子表观参与PMOP的发生发展过程并起着重要调控作用[7-8]。溴结构域蛋白4(BRD4)是表观调控蛋白BET家族成员[9]。研究发现,BRD4是一种转录调节因子,其可以与乙酰化染色质结合,参与细胞分裂循环过程中的基因稳定表达,在成骨细胞分化过程中BRD4也发挥重要作用[10-11]。鉴于BRD4的重要作用使其成为绝经后骨质疏松症的新兴治疗靶点。本研究通过去卵巢骨质疏松大鼠模型探讨BRD4表达与PMOP关系及六味地黄丸干预,旨在为中西医防治PMOP提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物:SPF级雌性SD大鼠60只,6～8月龄,购自武汉华联科生物科技有限公司动物中心,动物合格使用许可证号:SYXK(河北省)2021-006。本研究经湖南中医药大学动物实验伦理委员会审批同意实施(202104100009)。

1.1.2主要仪器:Discovery A型骨密度测试仪(Holigic公司),YLS-16A型小动物骨骼强度测定仪(济南益延公司)。

1.1.3主要试剂:六味地黄丸购自北京同仁堂(国药准字ZI9993068),阿仑膦酸钠片购自Merck公司(A4978)。BRD4抗体购自Abcam公司(ab289886)。β-actin抗体购自Abcam公司(ab8227);蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒和超敏ECL化学发光试剂盒均购自杭州碧云天生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1模型制备、分组和给药:参照文献[12]报道摘除双侧卵巢,建立绝经后骨质疏松症模型。腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg),无菌条件下腹部正中切口进腹,丝线结扎卵巢并摘除。缝合切口前腹腔内注入万古霉素10万单位。手术后大鼠常规单独饲养,自由饮水和进食。术后2周实验动物伤口完全愈合后合笼,灌胃给药,分为假手术组、模型组(生理盐水,10 mL/kg)、中药组(六味地黄丸385.7 mg/kg)、西药组(阿仑膦酸钠0.893 mg/kg)。观察大鼠体重、毛发色泽、饮水量、自主活动次数、易激惹表型等。

1.2.2骨密度和骨生物力学测定:完整分离双侧股骨,标本放置于骨密度测试仪平台上,分析检测整体股骨的骨密度(g/cm2)。同时,通过小动物骨骼强度测定仪,参照文献[13]报道采用三点弯曲法测量骨骼强度。

1.2.3骨组织结构观察:用药疗程结束后,取各组大鼠双侧股骨组织标本,4%多聚甲醛固定24 h,用10% EDTA脱钙液(pH值8.0)脱钙15 d后石蜡包埋。切片厚4 μm脱蜡,苏木素-伊红(HE)染色30 s,1%浓度盐酸酒精分化后伊红复染。

1.2.4BRD4蛋白表达水平检测:称取双侧股骨组织约50 mg,用含蛋白酶抑制剂的蛋白提取试剂盒制备蛋白。在10% SDS-PAGE分离胶中进行电泳,然后将分离的蛋白转移至PVDF膜上。用含0.05% Tween-20和5%脱脂牛奶的Tris缓冲液封闭膜,与一抗4 ℃孵育过夜。一抗BRD4工作浓度为1∶500,内参抗体工作浓度β-actin为1∶2 000,与HRP偶联的二抗孵育,用PBS洗涤膜后,加入超敏ECL化学发光试剂在暗室曝光洗片。底片扫描用Image J软件分析灰度值。

1.2.5PMOP中医证型生物信息学分析:PMOP相关数据集GSE56116从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库下载并用于获得BRD4信使RNA(mRNA)的差异表达。应用KEGG通路富集分析和GO富集分析预测差异表达的BRD4 mRNA的相关功能。GSE56116数据集按中医证型将共纳入10例PMOP患者,分为3组,肾阴虚者4例,肾阳虚者3例,非肾虚者3例[14-15]。

1.3 统计学方法

统计分析采用SPSS 25.0统计软件包进行数据处理。组间比较采用单因素方差分析,结果用均数±标准差表示,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组骨密度、骨强度和骨组织结构的变化

造模12周后,与假手术组比较,模型组大鼠股骨骨密度明显降低(表1);与模型组比较,中药组和西药组均能有效提高模型组大鼠骨密度和骨强度(表1),差异具有统计学意义(P<0.05);中药组与西药组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠股骨干组织HE染色结果显示,假手术组大鼠骨膜完整,骨小梁致密且宽;与假手术组比较,模型组骨小梁稀少且窄,小梁间距加大;中药组和西药组治疗后的大鼠则观察骨小梁明显增加,与模型组大鼠比较(图1),差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠骨密度、骨组织强度情况

图1 各组大鼠骨组织HE染色情况

2.2 各组大鼠骨组织中BRD4蛋白表达的变化

Western blot检测结果显示,与假手术组比较,模型组BRD4蛋白表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,中药和西药干预后,BRD4蛋白表达均呈现下降趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)。中药组与西药组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 各组大鼠骨组织BRD4蛋白表达情况

2.3 BRD4 mRNA表达与PMOP肾虚分型的分析

将GSE56116测序数据分为PMOP肾阴虚、肾阳虚、非肾虚3组,比较BRD4转录水平结果显示(图3A),肾阴虚组BRD4 mRNA表达明显高于肾阳虚组和非肾虚组,差异具有统计学意义(P<0.05)。为进一步研究BRD4在PMOP中的分子作用基础,将PMOP分为BRD4 mRNA高表达组和低表达组(图3B)。结果显示,BRD4 mRNA高表达涉及RHCE、WASF3、LTBP1、SVIP、STMP1等基因表达改变;BRD4 mRNA低表达涉及PCP4、CPN1和ARHGEF35等基因表达改变。提示BRD4 mRNA在肾阴虚PMOP中上调累积系列基因表达事件。

图3 BRD4 mRNA差异表达分析

2.4 BRD4表达调控相关信号通路及功能的预测分析

使用GSE56116数据对BRD4及其相互分子进行KEGG通路分析和GO功能富集分析。KEGG通路分析结果发现(图4A),BRD4表达上调涉及5-羟色胺能神经突触、血小板活性、神经配体受体反应以及钙离子信号通路;BRD4表达下调涉及细胞因子相互作用、JAK-STAT信号通路。GO富集分析结果发现(图4B),BRD4表达上调涉及第二信使介导的信号传导、出凝血信号通路;BRD4表达下调涉及离子跨膜转运、神经轴突导航等。提示BRD4表达在PMOP局部骨微环境中起重要调控作用。

图4 PMOP中BRD4表达的富集分析

3 讨论

尽管六味地黄丸治疗PMOP临床疗效取得肯定,但其作用于PMOP多成分、多靶点间的相互关系及作用机制仍有待深入研究[16]。中医对PMOP的病因病机、治则治法的认识均认为肾虚为发病的关键。本研究结果表明,六味地黄丸干预PMOP动物模型,可下调表观调控分子BRD4蛋白表达水平;提示六味地黄丸治疗PMOP和BRD4蛋白表达下调可能存在内在联系。公共数据库中BRD4基因表达与PMOP中医肾虚症候的相关性结果提示,BRD4基因表达与肾阴虚型PMOP密切相关。

最近的表观基因组研究发现,BET蛋白(BRD2、BRD3、BRD4和睾丸特异性BRDT)充当表观遗传调控阅读器,主要识别组蛋白尾部的乙酰化赖氨酸以调节染色质可塑性。研究表明,BRD4的抑制因子JQ1参与PMOP破骨细胞分化和病理性骨丢失的调控。破骨细胞的分化和形成依赖于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的激活[10]。RANKL与核因子κB受体活化因子(RANK)的结合会诱导肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的募集,从而刺激破骨细胞生成所需的下游MAPK和NF-κB信号通路。此外,BRD4可读取组蛋白的乙酰赖氨酸,从而改变染色质结构以确定干细胞命运和脂肪形成。敲除BRD4表达显著减轻糖皮质激素介导的对H3K9ac结合Runx2启动子的抑制、提高骨钙素和Runx2的表达、矿化基质堆积[11]。一般而言,表观遗传调控机制特别是DNA甲基化,可调节多种疾病的基因表达,包括与骨代谢有关的关键基因。本研究发现,肾阴虚组BRD4 mRNA表达明显高于肾阳虚组和非肾虚组,BRD4 mRNA高表达涉及RHCE、WASF3、LTBP1、SVIP、STMP1等基因表达改变;BRD4 mRNA低表达涉及PCP4、CPN1和ARHGEF35等基因表达改变。但是,BRD4是否与这些基因的互作参与肾阴虚型PMOP有待后续体内外实验予以证实。

综上所述,BRD4是肾阴虚型PMOP相关基因,其过表达可预测六味地黄丸疗效。BRD4调控的RANKL/MAPK/NF-κB信号传导途径可能参与PMOP的发生发展,BRD4有望成为PMOP的潜在治疗靶点。