蛋白质分析方法在生物化学实验教学中的应用*

宫长斌，陈可泉，贾红华

(南京工业大学生物化学工程实验教学示范中心，江苏 南京 210018)

1 简 介

蛋白质化学是生物化学教学中最重要的内容之一，蛋白质不仅参与了细胞中的许多生理过程，是探索生命机理的关键，也是重要的营养物质，广泛应用于工业、医学、营养学等行业[1]。对蛋白质在生物中的含量进行分析，可以进一步了解蛋白在生物体中的占比组成，帮助对蛋白质的表达、结构和功能进行分析，也可以帮助对工业用品、食品、饲料等物质的营养价值进行鉴定[2]。因此蛋白质的定性与定量检测，是生物技术、医学、食品、营养学等行业毕业生必须要掌握的知识点，也是生物化学实验教学中必备的实验项目，在实验教学中具有非常重要的地位，也是相关专业在生物化学课程中深入理解和研究蛋白质的重要基础。目前蛋白质的定量分析检测方法很多，其中很多种已应用于生物化学实验教学。表1列出了目前在教学中使用较多的几种蛋白质分析实验及其适用专业类型。

表1 蛋白质分析实验项目对课程体系的支撑情况和适用专业

2 不同蛋白质分析方法原理与特点

2.1 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

该方法是利用带电荷的胶体粒子在电场中移动的现象，用醋酸纤维薄膜作为支持物分离鉴定血清中多种蛋白质的实验方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，具有强渗透性，对分子移动无阻力等优点。用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法具有样品用量少、快速、方便、应用范围广、分离清晰等优点，实验使用设备为低压电泳仪和水平电泳槽。该实验方法具备实验操作简单，药品与设备成本低、微量快速等优点，目前已广泛应用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同功酶的分离以及免疫电泳。成为生物化学实验课常用的实验项目之一[3-4]。

2.2 微量凯氏定氮法

该方法作为最经典的蛋白质定量测定方法，目前广泛应用于食品、饲料加工、实验研究等领域，在生物化学实验教学中也是一种常用的实验教学项目。微量凯氏定氮法是利用蛋白质含氮量来测定蛋白质含量的一种方法，被测的天然含氮化合物与98%浓硫酸在高温(480 ℃以上)共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵，该过程称之为消化或消解。将消化后的溶液转移至凯氏定氮仪中，然后加入强碱，使硫酸铵中的铵根离子释放生成氨水。加热至沸腾，用水蒸汽将氨蒸馏入2%硼酸等弱酸溶液中，然后再用标准稀盐酸溶液进行滴定，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。凯氏定氮法优点是准确性高，但耗时长，需要对样品的高温消煮至少需要3 h，用到浓硫酸、盐酸等管控试剂，并且对测定样品蛋白质纯度以及是否含尿素、三聚氰胺等含有氮元素的杂质，有较高要求。针对以上问题雷红等[5]提出了将实验用蛋白质样品加入浓硫酸和硫酸铜催化剂后放置过夜再消化，减少消化时间的方法。张泽泉等[6]探讨了利用乙酸锌做沉淀剂，分离蛋白质与非蛋白氮，再用凯氏定氮法测定蛋白含量的方法。该方法是目前较为经典的蛋白质定量测定的实验方法。

2.3 紫外分光光度法

该方法是利用蛋白质分子中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸中的苯环结构含有共轭双键的特征，使得蛋白质在280 nm紫外波长处具有吸收紫外线的性质。在这个波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质的浓度呈正比关系。因此可以利用已知含量的蛋白质样品绘制标准曲线，标定未知蛋白质的含量。该方法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，但酸类物质和醇类物质均会影响紫外分光光度计法对小分子蛋白的测定[7]。在在蛋白质的柱层析分离或者各种生物来源的酶的制备中得到广泛应用。此方法在使用过程中，对蛋白质的种类和干扰物质有一定的要求，一是对于不适合测定与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质；二是若样品中含有有共轭双键的物质，如各种核甘酸、富马酸等吸收紫外线的物质，则会出现较大的误差。该方法不需要额外消耗药品，使用仪器为分光光度计，其他器皿均为试管、移液器等简单装备，成本低廉且操作方便，该方法较为适用于一些成份比较单纯的蛋白质类物质。

2.4 考马斯亮兰法

该方法是根据蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸与染料考马斯亮蓝相结合发生蓝色反应的原理设计的。考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，化合物在595 nm处吸光值与蛋白浓度成正比，可用于计算蛋白的含量。该方法最低蛋白质检测量可达1 mg，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，反应灵敏，实验成本不高，是目前生物化学实验教学中最常见的一种测定蛋白质含量的方法。该方法尽管相对与其它方法来说干扰物质较少，但由于每一种蛋白精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，导致蛋白质与该染料的结合能力不同，所以标准品的选择非常重要，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白或牛血清清蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。考马斯亮兰法的突出优点是：灵敏度高、干扰物质少、测定快速、简便，尤其适用于生物来源的蛋白质的检测。

2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺催化剂过硫酸铵或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。用该种凝胶电泳可利用生物大分子携带电荷的多少、分子量的大小进行分离。通过在电泳体系中加入阴离子表面活性剂的十二烷基磺酸钠(简称SDS)，破坏蛋白质分子中的氢键和疏水键，使蛋白质变性，再加入强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的二硫键，解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的复合物，消除蛋白质所带电荷的差异，使迁移率完全取决于蛋白质的分子量，因此可用此法测得的蛋白质的分子量，与用其它方法测得的分子量相比，误差一般在±10%以内，准确度高、重复性好。此方法虽然适用于大多数蛋白质分子量的测定，但对于一些蛋白质，如带有较大辅基的蛋白质、结构蛋白和一些含二硫键较多的蛋白质等是不适用的。该方法蛋白样品用量较少，但所用的仪器装置、药品价格较高，属于实验成本较高的实验。

2.6 蛋白质的呈色反应

蛋白质中的某些共价键或氨基酸残基中的某些化学基团可以与某些特殊试剂形成特定的有色物质，称之为呈色反应。该类反应由于各种蛋白质的氨基酸残基有所差异，所以不同类的蛋白质反应后呈现的颜色也不完全一样。而且，由于呈色反应是蛋白质侧链基团或者蛋白质中的共价键导致的颜色，一些拥有类似基团或共价键的非蛋白物质往往也能呈现类似的显色反应。因蛋白质为高分子物质，链长和所含氨基酸残基中的侧链基团数目有较大差异，显色反应很难对蛋白质进行定量测定，因此，这一类方法具有较大的局限性。常用的蛋白质呈色反应有双缩脲反应、茚三酮反应和黄色反应。双缩脲反应利用的是蛋白质类物质中氨基酸残基链接时的肽键加热至180 ℃可以缩合成一分子双缩脲并释放一份子氨的反应，再利用双缩脲在碱性溶液中与金属铜离子结合生成紫红色络合物用于检测。茚三酮反应利用的是氨基酸的氨基与茚三酮共热可产生紫色或黄色有色缩合物，因此可以用茚三酮定性检测或定量检测蛋白质。黄色反应则利用在蛋白质分子中具有芳香环的酪氨酸和色氨酸残基上的芳香环硝酸氧化，可转变为橘黄色的硝醌衍生物。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应。

3 结 语

在科研实验和工业生产中，蛋白质分析方法还有很多，例如同位素示踪质谱法、免疫电泳、等电聚焦等方法均已在科学研究中有所应用，但目前这些蛋白质的分析方法在仪器、药品等方面均成本较高、难以应用于实验教学。目前这些应用于本科生实验教学的蛋白质分析方法，特点与应用方向各有侧重，可根据教学要求予以选择。表2和表3汇总了这几种蛋白质分析方法的优缺点与对不同专业实验课程体系的支撑度。

表2 不同蛋白质分析实验项目的特点

表3 不同蛋白质分析实验项目对实践能力支撑度

随着国家对新工科建设的要求，培养适应国民经济建设需要，具有解决复杂工程问题能力的新工科人才对实验教学提出了新的要求[8]。在教学中合理运用各种不同的实验方法，培养掌握不同技能的新工科人才，是目前生物化学实验教学的重要教学改革方向。