丹参-葛根提取物对小鼠动脉粥样硬化的保护作用

张咪,张梦瑶,韩彦弢,赵文文

(青岛大学基础医学院,山东 青岛 266071)

心血管疾病是造成人类疾病死亡的主要原因,其中动脉粥样硬化(AS)的发病率逐年升高[1]。AS常因冠状动脉和脑动脉管腔闭塞或管壁破裂造成心肌梗死和脑卒中等严重后果,是老年人的主要病死原因之一[2]。目前AS的预防和治疗除了运动和饮食以外,多采取他汀类降血脂、抗血小板、扩血管、溶栓和抗凝等药物治疗,以及动脉再通、冠状动脉旁路移植等手术治疗[3-4]。近年来,传统中药由于具有毒性低、效果好、安全性高等优势被广泛关注。丹参和葛根都是常见的中药,对心血管疾病均起到很好的治疗作用,同时两者配伍使用还能够达到气血同治、生津通脉、活血化瘀等功效[5]。但是丹参和葛根协同治疗AS的研究较少。本文研究利用ApoE-/-小鼠构建AS模型,探究丹参-葛根提取物(DG)对AS的影响,以期为DG的临床应用提供依据。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

丹参和葛根购买自安国市昌达中药材饮片有限公司(中国,保定)。应用以下方法制备DG:将干燥的丹参、葛根粉碎并研磨成粉,各取100 g粉末置于1 L水中,25 ℃浸泡30 min,100 ℃提取45 min,重复此提取过程,冷冻干燥后制成粉末,4 ℃保存[6]。SPF级7周龄ApoE-/-雄性小鼠24只,购自济南朋悦实验动物繁育公司,其饲养与使用均严格按照国家动物卫生研究院《实验动物饲养与使用规定》和青岛大学伦理委员会的指导进行。Masson染色试剂盒和油红O染色试剂盒购买自Solarbio公司(中国,北京)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自南京建成生物公司(中国,南京)。

1.2 动物分组

ApoE-/-小鼠适应性喂养1周,随机分为空白组(A组)、模型组(B组)、DG低剂量组(200 mg/kg,C组)和DG高剂量组(400 mg/kg,D组),每组6只。空白组小鼠正常饲料喂养16周,每天灌胃生理盐水;模型组、DG低剂量组、DG高剂量组小鼠高糖高脂饲料喂养16周建立AS不稳定斑块模型,模型组每天灌胃生理盐水,DG低剂量组每天灌胃DG提取液200 mg/kg,DG高剂量组每天灌胃DG提取液400 mg/kg。

1.3 检测指标及方法

1.3.1标本采集 实验结束后,将小鼠麻醉进行眼球取血,立即处死并将其固定在手术板上,沿颈部剪开皮肤,暴露右侧颈总动脉,剪下管套两端长度约为0.5 cm的血管。

1.3.2血清血脂水平的检测 将采集的血液静置30 min, 4 ℃、4 500 r/min离心20 min,取上清,应用ELISA试剂盒检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平,按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3组织学观察 将离体的颈总动脉用40 g/L多聚甲醛固定2 h,PBS清洗后,置于300 g/L葡萄糖中,随后加入OTC包埋剂,置于液氮中速冻,使用冷冻切片机切5 μm的薄片,冷冻。应用油红O染色试剂盒和Masson染色试剂盒对各组小鼠主动脉脂质和胶原水平进行观察,按试剂盒说明书方法进行操作。

1.3.4血清中氧化应激因子以及炎症因子的检测应用ELISA试剂盒,分别检测各组小鼠血清氧化应激因子血清丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD),炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素12(IL-12)、可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)、可溶性血管细胞黏附分子1(sVCAM-1)水平,按试剂盒说明书进行操作。所有实验至少独立重复3次。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 各组小鼠血清脂质水平比较

各组小鼠血清脂质水平比较差异具有显著性(F=180.0～564.6,P<0.001),其中模型组小鼠血清TG、TC和LDL-C水平显著高于空白组, DG低剂量组和DG高剂量组TG、TC和LDL-C水平较模型组显著降低, DG高剂量组各指标低于DG低剂量组,差异均有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 各组小鼠血脂水平比较

2.2 各组小鼠AS斑块脂质水平比较

油红O染色观察显示,空白组小鼠主动脉内膜光滑,未见明显的病理改变;模型组小鼠主动脉内膜增厚、粗糙,能观察到明显的斑块形成,并且红色的脂质含量显著升高。与模型组相比,DG低剂量组小鼠主动脉内膜变薄,斑块形成明显减少,脂质含量略降低;DG高剂量组小鼠主动脉内膜变光滑,几乎观察不到明显的斑块形成,厚度显著变薄,脂质含量显著降低(图1)。

A:空白组;B:模型组;C:DG低剂量组;D:DG高剂量组。200倍。

2.3 各组小鼠AS斑块胶原水平比较

与空白组相比,模型组小鼠冠状动脉斑块面积增加,蓝色的胶原蛋白含量显著降低;而DG低剂量组和DG高剂量组小鼠冠状动脉胶原蛋白含量显著升高,纤维帽的厚度增加,斑块稳定性增加(图2)。

A:空白组;B:模型组;C:DG低剂量组;D:DG高剂量组。Masson染色,200倍。

2.4 各组小鼠血清氧化应激分子水平比较

与空白组相比,模型组小鼠MDA水平显著升高,SOD和GSH水平显著降低;与模型组比较,DG低剂量组和高剂量组MDA水平显著降低,SOD和GSH水平显著增高,差异均具有统计学意义(F=133.0～194.7,P<0.001);并且DG高剂量组与DG低剂量组比较差异有显著性(P<0.001)。见表2。

表2 各组小鼠血清中氧化应激相关分子水平比较

2.5 各组小鼠血清炎症因子水平比较

与空白组相比,模型组小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-12、sICAM-1和sVCAM-1水平显著升高;与模型组相比,DG低剂量组和DG高剂量组血清中炎症因子的水平显著降低,并且DG高剂量组各指标较DG低剂量组降低更明显,差异有统计学意义(F=247.0～371.0,P<0.001)。见表3。

表3 各组小鼠血清炎症因子水平比较

3 讨 论

AS是一种慢性炎症性疾病,是多种心脑血管疾病和外周动脉疾病的病理基础[7]。AS的形成主要是由于血液中脂质成分沉积,导致平滑肌细胞和与A组相比,*F=247.0～371.0,P<0.001;与B组相比,#P<0.001;与C组相比,△P<0.001。

胶原纤维增多,进而形成粥糜样含脂坏死病灶区,造成血管壁硬化[8]。因此,治疗和预防AS的主要策略是降低脂质水平、抑制炎症反应和氧化应激水平。AS不稳定斑块一旦破裂就会引起一系列的急性疾病如脑卒中、急性心肌梗死等的发生,因此增加斑块的稳定性也是一种重要的策略。

DG是经典的临床配伍药对,始见于《施今墨药对》[5]。DG具有很好的抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等作用[9-11],在防治冠心病心绞痛、心肌缺血再灌注损伤、2型糖尿病、急性脑梗死、骨质疏松等方面已经有广泛应用[12]。鉴于DG具有良好的抗炎抗氧化效果,本文探讨其对AS的保护作用。

血液中TG、TC和LDL-C的过量和积累是形成斑块的首要原因[13-14]。本文研究通过饲喂高糖高脂饲料构建ApoE-/-小鼠不稳定斑块模型,结果显示模型组小鼠TG、TC和LDL-C的水平显著升高,提示AS模型建立成功;应用DG治疗能够降低TG、TC和LDL-C水平,使AS症状减轻。巨噬细胞和平滑肌细胞摄取沉积的脂质形成泡沫细胞,泡沫细胞聚集形成脂纹,随后大量的胶原纤维、少数弹性纤维以及蛋白聚糖形成纤维斑块[15-16];随着胶原纤维的进一步聚集,泡沫细胞崩解,释放溶酶体酶,促进其他细胞坏死,进而形成粥样斑块;不稳定斑块一旦破裂就会导致血管栓塞[17-18]。本研究油红O染色结果显示,AS小鼠主动脉脂质水平显著升高,形成了明显的AS斑块;而与模型组相比,DG低剂量组和高剂量组斑块面积均明显减少,DG高剂量组几乎观察不到斑块的形成。Masson染色结果显示,模型组小鼠血管壁内形成明显的斑块,并且斑块中胶原含量很低,说明斑块不稳定;DG低剂量组和高剂量组小鼠主动脉内斑块面积减小,斑块胶原含量高,斑块稳定。提示DG对AS小鼠主动脉斑块的形成和稳定性有明显的抑制和改善作用。

氧化应激产生的ROS不仅对生物大分子如脂质、蛋白质等产生氧化作用,还参与细胞间信号传导,从多个层面影响AS的发生发展[19]。LDL和氧化修饰LDL的氧化还原失衡会引发自由基的连锁反应,引起严重的氧化应激反应,同时刺激单核细胞分化成巨噬细胞,进一步导致炎症反应的发生[20-21]。MDA是膜脂质过氧化的最终产物[22],SOD是机体重要的抗氧化酶[23],而GSH是机体重要的过氧化物分解酶[24],这些物质的含量反映机体脂质过氧化的程度[25]。本研究结果显示,AS模型组小鼠MDA的含量显著升高,SOD和GSH的活性显著降低;而经过DG治疗后小鼠血清中MDA水平显著降低,SOD和GSH水平显著升高,AS小鼠体内的氧化应激水平降低。TNF-α和IL-12是巨噬细胞产生的炎症因子,可以诱导细胞死亡和炎症反应,促进AS的发展和易损斑块的破裂[26]。内皮功能障碍是AS的早期指标,其特征表现为sICAM-1和sVACM-1的过度表达[27-28]。本研究结果显示,AS小鼠血清中sICAM-1和sVACM-1表达水平升高,炎症因子TNF-α和IL-12水平显著增加;应用低剂量和高剂量DG治疗后AS小鼠炎症因子和内皮细胞相关黏附分子的表达降低,表明DG可以抑制AS发生过程的炎症反应。

综上所述,DG能够通过降低脂质过氧化水平、抑制炎症反应、减少斑块面积以及提高斑块稳定性等多种途径来干预AS斑块形成的多个重要过程,从而在AS的发生发展中起到保护作用。