木耳菜总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究

曾稍俏

(漳州城市职业学院 食品工程系,福建 漳州 363000)

木耳菜(Gynuracusimbua)又称紫角叶、藤菜、豆腐菜等,是一种原产于亚热带地区的落葵科草本植物[1]。随着蔬菜产业迅速壮大和品种逐渐丰富,我国各地对木耳菜的种植数量逐渐增加。木耳菜含有丰富的蛋白质和维生素等营养物质,还含有机酸、黄酮、皂苷、黏多糖和葡聚糖等天然有效成分,具有清血解毒、降压、利尿、健脑、清热和降低胆固醇等生理作用,因此被广泛视为一种有益健康的蔬菜[2-3]。黄酮类化合物广泛存在于药草、蔬菜、谷物和水果等植物中,具有保护心脑血管、抗氧化和延缓衰老等生理活性[4-5]。目前,国内外对木耳菜的研究主要集中在栽培技术和加工工艺方面。许为义等[6]研究了基质和农药对木耳菜富硒能力的影响,结果表明相对于土壤基质,火山岩表现出更好的促进作用;草甘膦和氯氰菊酯对木耳菜的富硒均有促进效果,但草甘膦促进作用更为显著。郑植等[7]通过超声波辅助提取法对木耳菜的果胶资源进行提取,结果表明木耳菜果胶提取率达到19.22%,所提取的果胶符合国家标准,是一种具有抗氧化活性的低酯果胶。目前,尚未有关于木耳菜中黄酮的提取和开发的报道。因此,提高木耳菜的经济附加值,合理利用木耳菜资源,是木耳菜产业深度发展的重要方向。现代科技的发展推动了超声波辅助提取方法在黄酮提取中的应用,超声波辅助提取方法操作简便、无需添加化学试剂,能更好地保留黄酮化合物的活性成分,符合现代化和环保化的生产要求[8]。牛金鸽等[9]研究了超声波对藏羊皮胶原蛋白肽提取率及功能活性的影响,结果表明超声波辅助处理能显著提高胶原蛋白肽提取率,并能提高胶原蛋白肽的还原力和OH自由基清除率。因此,在单因素实验的基础上,进一步使用Box-Behnken设计对木耳菜总黄酮的超声波辅助提取工艺进行响应面优化,并确定最佳工艺参数,最后评价其抗氧化活性,为木耳菜作为天然绿色抗氧化添加剂的应用提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木耳菜,购自漳州市新华都超市西洋坪店,经黄宝华教授鉴定为落葵科木耳菜[Gynuracusimbua(D.Don) S.Moore in Journ];试剂有芦丁(福州飞净生物科技有限公司,标准品)、乙醇(动力派(汕头)食品有限公司,食品级)等,其他均为市售分析纯试剂。

仪器有超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,KQ100DE)、紫外-可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司,UV-200)。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 使用体积分数为70%的乙醇配制含有0.05g/L芦丁的标准液[10]。取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL的芦丁标准液,分别加入到10mL容量瓶中。随后,依次向容量瓶中加入2mL质量分数为6%的NaNO2溶液和1mL质量分数为12%的Al(NO)3溶液,摇匀静置5min后加入质量分数为4%的NaOH溶液2mL,定容后静置6min,得到标准曲线工作液,并测得510nm处的吸光度。以芦丁质量浓度作为横坐标,吸光度作为纵坐标,得到了标准曲线。通过回归分析,计算得到了回归方程:y=0.9637x-0.0475,相关系数R2为0.9996。

1.2.2 木耳菜总黄酮的提取 将购买的木耳菜从超市中取回后,进行充分洗净,并自然晾干。然后将完全干燥的木耳菜进行细碎处理,通过60目筛。取质量为m(g)的木耳菜样品粉末置于100mL烧瓶中,按照单因素工艺条件加一定体积的乙醇,并置于超声波辅助提取器中进行提取。提取结束后,通过过滤、浓缩和定容等步骤,得到木耳菜总黄酮提取液V(mL)。

吸取1mL木耳菜总黄酮提取液,按1.2.1方法显色,测得在510nm处的吸光度,通过回归方程换算得到总黄酮提取液质量浓度为b(g/L)。总黄酮提取率Y(mg/g)计算公式如下:

1.2.3 单因素实验 总黄酮提取的单因素水平如表1所示。由表1可知,通过一系列预实验成功确定了乙醇体积分数、超声时间、超声温度和液料比的最佳取值范围。在此基础上,通过固定其他3个因素水平,分别改变乙醇体积分数、超声时间、超声温度和液料比的水平,来考察这些变化对木耳菜总黄酮提取率的影响,以确定最佳的提取条件。

1.2.4 响应面实验设计 因素编码水平如表2所示。由表2可知,根据单因素实验结果,选择了4个自变量,以总黄酮提取率Y作为响应值,进一步使用Box-Behnken方法设计了一个包含4个因素和3个水平的响应面实验方案。

表2 因素编码水平Tab.2 Factor coding level

1.3 木耳菜总黄酮的抗氧化活性

1.3.1 DPPH自由基清除率 准确称取一定质量的DPPH粉末,用体积分数为70%的乙醇配成100mg/L DPPH储备液,并将其储存在2～4℃的环境中。将2.0mL的木耳菜总黄酮提取液分别吸取到10mL容量瓶中,加入2mL质量浓度为100mg/L的DPPH储备液到样品中,摇匀后在暗处静置30min。随后,使用紫外-可见分光光度计测定其在510nm处的吸光度,记为Ai。接下来,取相同体积的木耳菜总黄酮提取液,将其中的DPPH储备液用2.0mL无水乙醇代替,测得吸光度,记为Aj。将木耳菜总黄酮提取液替换成2.0mL无水乙醇,测得吸光度,记为A0。并以维生素C为阳性对照。DPPH自由基清除率R(%)计算公式如下:

1.3.2 OH自由基清除率 将2.0mL木耳菜总黄酮提取液分别吸取到10mL容量瓶中,先后加入6.0mmol/L FeSO4溶液、8.0mmol/L水杨酸溶液、8.8mmol/L H2O2溶液各2.0mL。摇匀后静置30min,接着在510nm处测定其吸光度值,记为Am;再以蒸馏水替换上述H2O2溶液,测得吸光度值为An;以蒸馏水替换上述木耳菜总黄酮提取液,测得吸光度值为Ak。并以维生素C为阳性对照。OH自由基的清除率Q(%)计算公式如下:

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响如图1所示。由图1可知,乙醇体积分数为70%时,提取率最大。这是因为当乙醇体积分数较小时,乙醇中的水分含量相对较高,乙醇的溶剂力较强,但溶剂的极性也相对较大,使得一些脂溶性和醇溶性的黄酮类物质不能充分溶解在乙醇中,从而降低了提取率。而当乙醇体积分数过高时,同样导致木耳菜中的一些非黄酮类脂溶性和醇溶性物质化合物的溶解和溶出,降低了黄酮的提取率[11]。因此,选择乙醇体积分数为70%。

图1 乙醇体积分数的影响图2 超声时间的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fractionFig.2 Effect of ultrasonic time

2.1.2 超声时间对总黄酮提取率的影响 超声时间对总黄酮提取率的影响如图2所示。由图2可知,超声时间为30min时,提取率最大。这是因为当超声时间较短时,植物细胞壁未能充分破坏,导致黄酮类化合物无法充分释放,从而降低了提取率。然而,随着超声时间的延长,植物细胞结构受到更大程度的破坏,进一步提高了木耳菜中总黄酮溶解出来的数量,提高了提取率。然而,当超声时间超过30min时,超声波的高强度震荡对总黄酮的分子结构造成一定程度的破坏,从而降低了提取率[12]。因此,选择超声时间为30min。

2.1.3 超声温度对总黄酮提取率的影响 超声温度对总黄酮提取率的影响如图3所示。由图3可知,超声温度为60℃时,提取率最大。这是因为当超声温度较低时,没有足够的热能来促进总黄酮的释放和溶解,总黄酮提取率较低。随着超声温度的升高,黄酮类化合物分子的热运动能量增加,扩散速率加快,从而增加了黄酮类化合物在溶剂中的溶解度,提高了总黄酮的提取率。然而,当超声温度超过60℃时,继续增加温度将导致部分黄酮类化合物化学键断裂,分子结构也会发生改变,从而降低了黄酮类化合物的稳定性和可提取性[13]。因此,选择超声温度为60℃。

图3 超声温度的影响图4 液料比的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperatureFig.4 Effect of liquid-material ratio

2.1.4 液料比对总黄酮提取率的影响 液料比对总黄酮提取率的影响如图4所示。由图4可知,液料比为40mL/g时,提取率最大。这是因为液料比较小时,溶剂的量相对较少,不能充分地覆盖原料,导致超声波无法充分地穿透和破坏原料细胞壁,影响了总黄酮的释放和溶解。随着液料比的增加,提取溶剂相对于样品的比例增加,溶剂能更好地覆盖样品表面,使得样品中的化合物被更容易地提取出来,有利于样品中总黄酮的溶出。但液料比高于40mL/g时,样品中总黄酮已经完全溶解出来,进一步增加液料比将无法提高总黄酮的提取率,反而会增加后续过滤、分离和浓缩等单元操作中总黄酮的损失[14]。因此,选择液料比为40mL/g。

2.2 木耳菜总黄酮优化实验及结果

2.2.1 响应面实验设计及结果 使用Box-Behnken设计方法所得到的实验设计方案和结果如表3所示。由表3可知,根据单因素实验结果,选择了乙醇体积分数(A)、超声时间(B)、超声温度(C)和液料比(D)4个自变量,并以总黄酮提取率Y作为响应值。

表3 Box-Behnken实验结果Tab.3 Experimental results of Box-Behnken

2.2.2 回归模型的建立及显著性分析 使用Design-Expert 8.05b软件对表3中的实验数据进行了方差分析,以确定实验因素对响应变量方差的贡献程度,得到了回归模型方程为Y=53.49+4.42A-1.24B+5.35C+3.05D+2.72AB-1.96AC+1.17AD+0.92BC-2.00BD-0.10CD-7.58A2-2.74B2-7.55C2-7.49D2。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

2.2.3 因素交互作用对木耳菜总黄酮提取率的影响 为了更直观地观察4个因素的交互作用,绘制了等高线图和响应面图,如图5～10所示。可以借助响应面和等高线来评估各个因素之间的交互作用对结果的影响程度。如果响应面越陡峭、等高线越密集,说明各因素之间的交互作用对实验结果产生较大的影响;反之,如果响应面较平缓、等高线较稀疏,则表示交互作用对实验结果的影响较小[15]。

(a) 响应面图 (b) 等高线图图5 乙醇体积分数与超声时间的交互作用Fig.5 Interaction between ethanol volume fraction and ultrasonic time

由图5可知,当乙醇体积分数固定时,木耳菜总黄酮的提取率随着超声时间的增加呈现先增加后降低的趋势。同样的,当超声时间保持不变时,提取率随着乙醇体积分数的增加先升高后降低。从响应面图的陡峭程度和等高线图的形状可以看出,二者之间存在极显著的交互作用。

由图6可知,当乙醇体积分数固定时,木耳菜总黄酮的提取率随着超声温度的增加呈现先增加后降低的趋势。同样的,当超声温度保持不变时,提取率随着乙醇体积分数的增加先升高后降低。从响应面图的陡峭程度和等高线图的形状可以看出,二者之间存在极显著的交互作用。

(a) 响应面图 (b) 等高线图图6 乙醇体积分数与超声温度的交互作用Fig.6 Interaction between ethanol volume fraction and ultrasonic temperature

由图7可知,当乙醇体积分数固定时,木耳菜总黄酮的提取率随着液料比的增加呈现先增加后降低的趋势。同样的,当液料比保持不变时,提取率随着乙醇体积分数的增加先升高后降低。从响应面图的陡峭程度和等高线图的形状可以看出,二者之间存在显著的交互作用。

(a) 响应面图 (b) 等高线图图7 乙醇体积分数与液料比的交互作用Fig.7 Interaction between ethanol volume fraction and liquid-material ratio

由图8可知,当超声时间固定时,木耳菜总黄酮的提取率随着超声温度的升高呈现先增加后降低的趋势。同样的,当超声温度保持不变时,提取率随着超声时间的延长先升高后降低。从响应面图的陡峭度和等高线图的形状可以看出,二者之间存在的交互作用不显著。

(a) 响应面图 (b) 等高线图图8 超声时间与超声温度的交互作用Fig.8 Interaction between ultrasonic time and temperature

由图9可知,当超声时间固定时,木耳菜总黄酮的提取率随着液料比的增加呈现先增加后降低的趋势。同样的,当液料比保持不变时,提取率随着超声时间的增加先升高后降低。从响应面图的陡峭程度和等高线图的形状可以看出,二者之间存在极显著的交互作用。

(a) 响应面图 (b) 等高线图图9 超声时间与液料比的交互作用Fig.9 Interaction between ultrasonic time and liquid-material ratio

由图10可知,当超声温度固定时,木耳菜总黄酮的提取率随着液料比的增加呈现先增加后降低的趋势。同样的,当液料比保持不变时,提取率随着超声温度的升高先升高后降低。从响应面图的陡峭程度和等高线图的形状可以看出,二者之间存在的交互作用不显著。

(a) 响应面图 (b) 等高线图图10 超声温度与液料比的交互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic temperature and liquid-material ratio

2.2.4 回归模型最优化验证 经过使用响应面软件进行优化后,得到了最优的木耳菜总黄酮提取工艺条件参数:乙醇体积分数为72.44%、超声时间为28.61min、超声温度为63.13℃、液料比为42.39mL/g。模型预测显示,木耳菜的总黄酮提取率可达到55.32mg/g。为了操作的便捷性,将最佳工艺参数微调为整数:乙醇体积分数为72%、超声时间为29min、超声温度为63℃、液料比为42mL/g。在此条件下,进行3次平行实验,实际得到木耳菜总黄酮的提取率为54.23mg/g,与理论最大值的相对误差仅为1.97%,这说明回归模型对于木耳菜总黄酮的提取率预测结果准确可靠。值得注意的是,经过响应面优化后,木耳菜总黄酮的提取率与响应面实验中心点提取率最高的2组数据是一致的。通过比较均值,发现优化后的总黄酮提取率比中心点高0.74mg/g,即提高了1.38%,说明通过响应面优化可以获得更高提取率的工艺参数,实现更高效的木耳菜总黄酮提取,为后续的研究和应用提供了有力支持。

2.3 木耳菜总黄酮的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率 维生素C和木耳菜总黄酮对自由基的清除率如图11所示。由图11(a)可知,随着木耳菜总黄酮质量浓度的增加,可以观察到对DPPH自由基的清除率逐渐提高。实验结果显示,木耳菜总黄酮的半数抑制浓度值(IC50)为69.61mg/L。特别是当木耳菜总黄酮的质量浓度达到100mg/L时,其对DPPH自由基的清除率可达到68.67%,相当于维生素C的82.62%。说明木耳菜总黄酮具备一定的DPPH自由基清除能力,但相对于维生素C来说,其清除能力略低。

(a) DPPH自由基 (b) OH自由基图11 维生素C和总黄酮对自由基的清除率Fig.11 Free radical scavenging rate of vitamin C and total flavonoids

2.3.2 OH自由基清除率 由图11(b)可知,随着木耳菜总黄酮质量浓度的增加,可以观察到对OH自由基的清除率逐渐提高。实验结果显示,其IC50值为154.90mg/L。特别是当木耳菜总黄酮质量浓度为250mg/L时,观察到对OH自由基的清除率可达到75.63%,相当于维生素C的86.97%。说明木耳菜总黄酮具备一定的OH自由基清除能力,但相对于维生素C来说,其清除能力略低。

综上所述,木耳菜总黄酮具有显著的抗氧化潜力,为其作为天然绿色抗氧化添加剂的应用提供了科学基础和可行性。

3 结论

以木耳菜为原料,通过单因素实验和响应面优化了木耳菜总黄酮的超声波辅助提取工艺。实验结果表明,最佳提取参数是乙醇体积分数为72%、超声时间为29min、超声温度为63℃以及液料比为42mL/g。根据实际实验数据,木耳菜总黄酮的提取率为54.23mg/g,相对误差仅为1.97%,验证了回归模型的可靠性。此外,木耳菜总黄酮具有一定的自由基清除能力,对DPPH自由基、OH自由基的IC50值分别为69.61、154.90mg/L,相对于维生素C来说其清除能力略低。这项研究表明木耳菜总黄酮具有抗氧化潜力,为其作为天然绿色抗氧化添加剂的应用提供了科学基础和可行性。