沼泽生红冬孢酵母类胡萝卜素合成条件的优化

周 可，张峰峰，赵 琼，田 阳，谢凤行，赵玉洁

（天津市农业科学院农业资源与环境研究所，天津 300384）

红酵母是一种广泛存在于自然界的腐生菌，其抗逆性较强，可合成类胡萝卜素，包括β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素等[1]. 类胡萝卜素由于具有营养、药用、保健等功能，被广泛应用于医药、食品、饲料、水产养殖、化妆品等行业[2]，据报道，2022 年全球类胡萝卜素市场价值预计将达到20 亿美元[3].红酵母在水产养殖中主要用于改变养殖动物体色、提高免疫力和抗氧化能力等[4-5]，但目前红酵母合成色素的能力都比较低，不利于大规模工业化生产.因此，筛选出可高效合成类胡萝卜素的菌株并优化其合成条件，进一步提高色素产量是类胡萝卜素生物合成产业化发展的基础. 目前研究者们已经从环境中选育出红色色素产量较高的胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）[6-7]、黏红酵母（Rhodotorula glutinis）[8-9]、沼泽生红冬孢酵母（Rhodotorula paludigenum）[10-11]、海洋红酵母[12]等优良菌株.Braunwald 等[13]研究发现，提高培养基中的碳氮比可显著提高黏红酵母类胡萝卜素的生物合成；Zhang 等[14]研究发现，黑暗、低温、碳氮比为90 的培养条件有利于黏红酵母生物量的累积和类胡萝卜素合成，类胡萝卜素质量浓度可达4.2 mg/L；Dias 等[15]研究发现，pH 值和溶解氧能显著影响圆红冬胞酵母（Rhodosporidium toruloides）NCYC 921 类胡萝卜素的合成；Banzatto 等[16]研究发现，在糖蜜中适当添加尿素更利于深红酵母（Rhodotorula rubra）的生长和色素合成；Maldonade 等[8]研究发现，相对于碳源，胶红酵母菌类胡萝卜素的合成对培养基中氮源的变化更敏感.除了优化培养条件外，还可通过向培养基中添加促进剂，如番茄汁、花生油、玉米浆、乙醇等提高菌株的类胡萝卜素合成能力[17-19].不同红酵母的类胡萝卜素合成途径存在差异，意味着不同促进剂对不同的红酵母菌株类胡萝卜素合成能力的影响也存在差异.

本研究拟对实验室前期从水产养殖中分离的红酵母菌进行类胡萝卜素含量测定，筛选类胡萝卜素合成能力强的菌株，在培养基中加入可促进三羧酸循环的中间物质（柠檬酸钠、乙醇）和色素合成的关键前体物质（番茄红素、β-胡萝卜素），研究番茄匀浆、胡萝卜汁、柠檬酸钠、乙醇对该菌株类胡萝卜素合成的影响，以优化菌株类胡萝卜素的合成条件从而提高含量.为利用红酵母进行类胡萝卜素的生物合成产业化开发提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 菌株

本课题组前期从养殖环境中分离出8 个红酵母菌分离株，编号分别为CN6、CN7、DN9、DN11、DD1、DD2、DD3、DG2，其中，CN6、CN7、DD1、DD2、DD3 鉴定为Rhodosporidium paludigenum，DG2 鉴定为Rhodotorula minuta，DN9 和DN11 鉴定为Rhodotorula asteroides.此外，从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买了红法夫酵母（Phaffia rhodozyma），编号为F.

1.2 培养基及种子液的准备

本课题组对基础培养基进行优化，成分为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，番茄汁30 mL/L.培养基初始pH 值为5.0，115 ℃高压灭菌20 min.从试管斜面上刮取一环菌种，接种于装有30 mL 培养基的250 mL 三角瓶中，25 ℃、200 r/min 振荡培养24 h 作为种子液.

1.3 类胡萝卜素高产菌株的筛选

将不同菌株的种子液按5%的接种量接种于装有40 mL 培养基的250 mL 三角瓶中，25 ℃、200 r/min 振荡培养72 h 后收获菌体，测菌株生物量和类胡萝卜素含量，筛选类胡萝卜素含量高的菌株用于后续实验.

1.4 番茄匀浆对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响

取新鲜成熟番茄用果汁机匀浆后过滤，滤液经360 W 微波处理20 s，过滤灭菌后即为番茄匀浆.在基础培养基中添加5、10、20、40 和80 mL/L 的番茄匀浆，每个处理3 次重复，以筛选到的CN7 菌株作为实验菌株，按1.3 中的方法进行培养，72 h 后收集菌体，测生物量和类胡萝卜素含量.

1.5 胡萝卜汁对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响

新鲜胡萝卜捣碎后添加少量水，用果汁机制备匀浆，过滤灭菌后分别按10、20、40、60 和80 mL/L 的量添加到培养基中，每个处理3 次重复.按1.3 中的方法进行培养，72 h 后收集菌体，测生物量和类胡萝卜素含量.

1.6 柠檬酸钠对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响

在基础培养基中分别添加1.0、2.0、4.0、6.0 和8.0 g/L 的柠檬酸钠，每个处理3 次重复，按1.3 中的方法进行培养，72 h 后收集菌体，测生物量和类胡萝卜素含量.

1.7 乙醇对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响

按1.3 中的方法接种培养菌株24 h 后，在发酵液中分别添加0.5、1.5、2.5、3.5 和4.5 mL/L 的乙醇，每个处理3 次重复，培养72 h 后收获菌体，测生物量和类胡萝卜素含量.

1.8 类胡萝卜素含量的测定方法

先将10 mL 离心管编号，称重记录.每个处理取5 mL菌液6 份，6 000 r/min 离心10 min，弃去上清液.加入5 mL 蒸馏水，冲洗后继续以6 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，再加入5 mL 蒸馏水，冲洗后6 000 r/min 离心10 min，弃上清，称重记录.其中3 份95 ℃烘24 h，用于测量干质量，另外3 份用于提取色素.提色素时，先将二甲基砜（DMSO）在水浴锅中45 ℃预热，然后取2 mL 预热过的DMSO 加入菌液中，充分振荡均匀，45 ℃水浴10 min，加入5 mL 无水乙醇浸提40 min，6 000 r/min 常温离心10 min，将上清液转入新的离心管中，再加5 mL 无水乙醇浸提40 min，浸提直至菌体细胞无色，合并所有上清液，在474 nm 处测OD 值.

类胡萝卜素含量（μg/g）=OD474×V×D/（0.16×W）式中：OD474为474 nm 处的吸光度值；V为提取所用有机溶剂体积；D为稀释倍数；0.16 为类胡萝卜素含量与OD474的换算系数；W为酵母菌的干质量（g）.

1.9 数据处理与统计分析

应用Origin 9.0 软件对实验数据进行整理、作图，所得数据以（平均值±标准差）表示.应用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析.采用Duncan 法，在P=0.05水平上进行数据差异统计学意义的检验.

2 结果与分析

2.1 类胡萝卜素合成能力强的红酵母菌株的筛选

本研究中分离得到的8 个红酵母菌株类胡萝卜素的合成能力差异显著，如图1 所示.由图1 可以看出，有4 株菌的类胡萝卜素含量显著高于红法夫酵母F（P＜0.05）的含量，分别为DG2、CN6、CN7 和DN9，含量分别为红法夫酵母F 的1.45、1.43、1.97、1.51 倍.其中，CN7 菌株的类胡萝卜素含量最高，达到了170.11 μg/g，显著高于其他菌株，因此后续研究以CN7 为实验菌株.

图1 不同红酵母菌株类胡萝卜素的含量Fig.1 Carotenoid content in different Rhodotorula strains

2.2 番茄匀浆对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响

培养基中添加不同量的番茄匀浆对红酵母菌CN7 菌株合成类胡萝卜素的影响如图2 所示.由图2可以看出，向培养基中添加不同量的番茄匀浆会显著影响CN7 的类胡萝卜素含量.其中，添加10 mL/L 和20 mL/L 的番茄匀浆处理下，CN7 类胡萝卜素的含量显著高于其他的番茄匀浆处理，这2 个处理之间的差异不具有统计学意义（P＞0.05）.添加20 mL/L 番茄匀浆的处理中，类胡萝卜素含量最高，达到239.19 μg/g，而添加80 mL/L 番茄匀浆的处理中，类胡萝卜素的含量最低，仅为205.70 μg/g.所有添加番茄匀浆处理中的类胡萝卜素含量均高于零添加的含量，说明番茄匀浆的添加有利于菌株CN7 类胡萝卜素的合成.

图2 不同含量番茄匀浆条件下CN7 类胡萝卜素的含量Fig.2 Carotenoid content in CN7 under different content of tomato homogenate

2.3 胡萝卜汁对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响

培养基中添加不同量的胡萝卜汁对CN7 菌株的类胡萝卜素含量的影响如图3 所示. 由图3 可以看出，随着胡萝卜汁添加量的增加，CN7 菌株合成类胡萝卜素的能力增强.添加80 mL/L 胡萝卜汁处理的类胡萝卜素含量最高，达到342.82 μg/g，显著高于其他处理.添加5 mL/L 与10 mL/L 之间及添加20 mL/L与40 mL/L 之间，CN7 的类胡萝卜素含量差异不具有统计学意义. 80 mL/L 的胡萝卜汁添加处理下CN7 菌株的类胡萝卜素含量远远大于80 mL/L 番茄匀浆处理下的含量，说明胡萝卜汁更利于CN7 类胡萝卜素的合成.这可能是因为胡萝卜汁含有丰富的β-胡萝卜素，而在类胡萝卜素的生物合成途径中β-胡萝卜素是底物番茄红素环化的一个产物[20].

图3 不同含量胡萝卜汁条件下CN7 类胡萝卜素的含量Fig.3 Carotenoid content in CN7 under different content of carrot juice

2.4 柠檬酸钠对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响

柠檬酸不仅可用作某些微生物的碳源，还可以作为细胞生长和代谢的良好调节剂.培养基中添加不同质量浓度的柠檬酸对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响如图4 所示.由图4 可以看出，CN7 菌株类胡萝卜素的合成能力随培养基中柠檬酸钠质量浓度的升高呈现上升趋势，柠檬酸钠质量浓度为6.0 g/L 时，CN7菌株的类胡萝卜素合成能力最强，含量达到255.62 μg/g，显著高于1.0 g/L 和2.0 g/L 的处理（P＜0.05），略高于柠檬酸钠质量浓度8.0 g/L 的处理（P＞0.05）.

图4 不同质量浓度柠檬酸钠条件下CN7 类胡萝卜素的含量Fig.4 Carotenid content in CN7 under different mass concentration of sodium cirate

2.5 乙醇对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响

向培养基中添加乙醇对CN7 菌株类胡萝卜素合成的影响如图5 所示.

图5 不同含量乙醇条件下CN7 菌株类胡萝卜素的含量Fig.5 Carotenoid content in CN7 under different content of ethanol

由图5 可以看出，培养基中乙醇含量为0.5～4.5 mL/L 范围内，CN7 菌株的类胡萝卜素含量为248.23 ～280.00 μg/g，均高于初始的170.11 μg/g，说明乙醇对CN7 菌株类胡萝卜素的合成有一定的促进作用. 其中，添加1.5 mL/L 乙醇处理下CN7 菌株类胡萝卜素的含量最高，达到280.00 μg/g，显著高于0.5 mL/L乙醇处理（P＜0.05），略高于3.5 mL/L 和4.5 mL/L 乙醇处理（P＞0.05）.

3 讨论与结论

生物体内物质的合成受多种因素调控，如果合成途径及相关酶比较清楚，通过加入生物合成途径中的中间物质或前体物质，或是对相关酶进行调控，可有效提高产量[21-22].本研究以实验室前期分离的产类胡萝卜素的8 株红酵母菌株为实验材料，筛选出类胡萝卜素合成能力强的沼泽生红冬孢酵母菌CN7，培养基中添加不同量的番茄匀浆、胡萝卜汁、柠檬酸钠、乙醇，均显著提高了CN7 菌株类胡萝素的合成能力.

番茄红素（番茄匀浆）和β-胡萝卜素（胡萝卜汁）作为类胡萝卜素合成的关键前体物质，对产物有直接影响.朱晓立等[23]、胡向东等[24]的研究表明，培养基中添加胡萝卜汁或番茄汁可显著提高红法夫酵母虾青素的含量和产量.番茄红素和β-胡萝卜素是类胡萝卜素生物合成途径中的节点，在红法夫酵母的虾青素生物合成途径中，番茄红素经过2 步环化形成β-胡萝卜素，β-胡萝卜素经氧化形成虾青素[25]；而在其他红酵母中，番茄红素可能环化生成β-胡萝卜素、α-胡萝卜素，β-胡萝卜素酮化、羟化后形成虾青素[26].本研究中，向培养基中添加80 mL/L 胡萝卜汁，CN7 菌株的类胡萝素含量由170.11 μg/g 提高到342.82 μg/g，显著高于添加20 mL/L 番茄匀浆的类胡萝卜含量（239.19 μg/g）.这说明CN7 菌株的类胡萝卜素合成途径不同于红法夫酵母，番茄红素环化产物不只有β-胡萝卜素.对于红酵母中类胡萝卜素合成代谢的具体途径和关键调控基因，还需要后续研究进行确定.

柠檬酸既可作为微生物生长的碳源，也是细胞代谢调控因子.廖春丽等[27]研究发现，柠檬酸浓度对三孢布拉霉（Blakeslea trispora）的β-胡萝卜素合成有显著影响；肖安风等[28]研究发现，培养基中添加柠檬酸、乙醇等物质可使法夫酵母JMU-VDL668 菌株的虾青素产量较对照提高88.8%；茹毅等[19]研究发现，乙醇可促进红法夫酵母细胞代谢中丙酮酸、乙酰辅酶A 代谢节点处的通量，使流向虾青素合成途径的通量增加；沈宁燕等[29]研究认为，乳酸钠给法夫酵母提供了更多的乙酰辅酶A 等前体物质以及能量，因此促进了虾青素的合成；郭锐等[30]研究发现，过表达RKAcat 2基因可促进红冬孢酵母中更多的乙酰辅酶A 进入甲羟戊酸途径，从而提高了类胡萝卜素的合成水平.本研究在培养基中加入可促进三羧酸循环的中间物质柠檬酸钠和乙醇，发现上述促进剂均有效提高了红酵母类胡萝卜素的合成，与前人的研究结果一致.乙醇能有效提高红酵母虾青素合成过程中甲羟戊酸合成途径关键酶的活性，使流向虾青素合成途径的通量增加，进而促进了虾青素的合成[19].至于柠檬酸钠和乙醇在CN7菌株中是否也是通过促进乙酰辅酶A 的合成来促进类胡萝卜素的合成，还是通过调控其他关键酶基因的表达来促进色素的合成，将在后续研究中进行确定.添加柠檬酸钠能显著提高红酵母菌CN7 菌株合成类胡萝卜素的能力，这与孔维宝等[21]的研究结果一致，但添加不同浓度柠檬酸钠处理下CN7 菌株类胡萝卜素的含量均高于胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）K-1的含量（180.14 μg/g）.

本研究向CN7 菌株培养基中分别添加4 种物质，虽然均可提高其类胡萝素的合成能力，但添加不同物质产生的效果不同，提高CN7 菌株类胡萝卜素合成能力的顺序依次为胡萝卜汁＞乙醇＞柠檬酸钠＞番茄匀浆，即胡萝卜汁对CN7 菌株合成类胡萝卜素的促进作用最明显.促进剂的最佳添加量分别为：胡萝卜汁80 mL/L、乙醇1.5 mL/L、柠檬酸钠6.0 g/L、番茄匀浆20 mL/L.在上述条件下，CN7 菌株的类胡萝素含量分别达到342.82、280.00、255.62、239.19 μg/g，较初始值的170.11 μg/g 分别提高了101.5%、64.6%、50.3%、40.6%.