吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的荧光量子产率和荧光寿命

宋逸明, 沈 鉴, 刘传旸, 熊秋燃, 程 澄, 柴一荻, 王士峰, 吴 静*

1. 清华大学环境学院环境污染溯源与精细监管技术研究中心, 北京 100084 2. 清华苏州环境创新研究院先进监管技术仪器研发团队, 江苏 苏州 215163

引 言

荧光技术是一种重要的、 广泛使用的化学分析技术。 三维荧光光谱法是近年来发展成熟的一种先进的荧光分析方法, 广泛应用于环境科学[1-2]、 生物科学[3]、 食品科学[4]等领域。 清华大学环境学院基于三维荧光光谱自主研发了水污染预警溯源技术和配套仪器, 通过对比待检测样品与数据库中污染源的三维荧光光谱的相似度, 快速判断污染排放源, 已成功用于水体和工业园区的污染溯源[5-6]。 该技术成功将三维荧光光谱的应用从实验室拓展到企业和环境管理的第一线, 被《科技日报》评选为2018年国内十大技术突破。

然而, 在实际应用中, 部分荧光有机物拥有结构相近的发色团, 仅仅依靠三维荧光光谱很难准确识别物质种类。 荧光量子产率(quantum yield, QY)和荧光寿命(fluorescence lifetime, FL)是荧光化合物的重要发光参数[7], 更能反映物质结构的差异。 结构相近、 三维荧光光谱相似的荧光有机物, 其荧光量子产率和荧光寿命由于取代基的不同可能有显著差异。 因此, 荧光量子产率和荧光寿命的引进, 有望突破荧光有机物难以精准识别的问题。

本文选取吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸为研究对象。 3-甲基吲哚和L-色氨酸均包含具有给电子能力的吲哚环, 其三维荧光光谱与吲哚的相似。 围绕这三种物质, 本文主要测定了(1)三维荧光光谱、 (2)荧光量子产率和(3)荧光寿命。 本研究结果表明, 荧光量子产率和荧光寿命可用于具有相似三维荧光光谱的荧光有机物的精确区分, 为荧光有机物的精准识别与鉴定提供了一种有潜力的新方法。

图1 结构式(a)吲哚、 (b)3-甲基吲哚和(c)L-色氨酸Fig.1 The structural formulas of (a) indole, (b) 3-methylindole and (c) L-tryptophan

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

荧光量子产率和荧光寿命用稳态/瞬态荧光仪(FLS1000, Edinburgh Instruments, 英国)测量; 三维荧光光谱用荧光分光光度计(F2700, Hitachi, 日本)测量; 紫外-可见吸收光谱用紫外-分光光度计(DR6000, Hach, 美国)测量。

乙醇(J&K, HPLC, >99.9%), 吲哚(Sigma-Aldrich, >99%, 美国), 3-甲基吲哚(Sigma-Aldrich, GC, >99%, 美国), L-色氨酸(Sigma-Aldrich, HPLC, >99%, 美国), 实验用水为高纯水。 用乙醇为溶剂配制1 mmol·L-1的吲哚溶液、 3-甲基吲哚溶液和L-色氨酸溶液作为储备液, 置于4 ℃冰箱中避光保存备用。

1.2 测试方法及原理

1.2.1 三维荧光光谱

三维荧光光谱激发波长(excitation wavelength, EX)的扫描范围为220～450 nm, 发射波长(emission wavelength, EM)的扫描范围为230～550 nm。 步进波长5 nm, 扫描电压700 V, 扫描速度为12 000 nm·min-1。

1.2.2 荧光量子产率

荧光量子产率(φf)指荧光有机物吸收光子后所产生的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值[7]。 本实验中量子产率的测量采用绝对荧光量子产率测量技术。 使用的积分球是一个内壁涂有白色漫反射材料的空腔球体, 由类聚四氟乙烯材料加工而成的高反射性的内表面, 在400～1 500 nm光谱范围内反射率>99%, 在250～2 500 nm光谱范围内反射率>95%。 整个测试过程分两步: (1)根据待测溶液设置激发波长和发射波长的范围, 扫描纯溶剂的荧光发射光谱; (2)相同条件下扫描待测溶液的荧光发射光谱。 仪器自动计算样品吸收的光子数与随后发射的光子数的比值。

1.2.3 荧光寿命

荧光寿命(τ)指当切断激发光后荧光强度衰减至原强度的1/e所经历的时间[7]。 不同的分子构象产生不同的荧光, 其荧光寿命也各异,τ可用多指数方程来表示

(1)

式(1)中,R(t)为荧光总强度,Bi和τi分别表示不同分子构象的指前因子和荧光寿命。 本实验中荧光寿命的测量采用时间相关单光子计数技术。 使用脉冲光激发样品, 利用光子探测装置对荧光信号进行探测, 每一个光子计数信号都会落入一个对应的时间窗口, 经过一定时间的统计叠加后即得到荧光寿命曲线。 几十万次重复以后, 不同的时间通道累积下来的光子数目不同, 以光子数对时间作图, 经平滑处理后得到时间分辨荧光光谱, 拟合后得到荧光寿命。 光源采用EPLED系列皮秒脉冲二极管激光器, 激光波长为254.5 nm, 荧光寿命测量范围为50 ns, 分析通道数目为2 048。

2 结果与讨论

2.1 三维荧光光谱

吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的典型三维荧光光谱(图2)均存在2个明显的荧光区域, 分别位于EX=250～300 nm和EM=310～420 nm、 EX=220～230 nm和EM=310～420 nm, 各区域内分别存在一个荧光峰。 各荧光峰的激发波长和发射波长(表示为[激发波长, 发射波长])十分接近, 吲哚的两个荧光峰的激发波长和发射波长分别为[275, 345]、 [220, 345] nm, 记为峰1和峰2(Peak 1, Peak 2); 3-甲基吲哚为[280, 365]、 [225, 365] nm, 记为峰3和峰4(Peak 3, Peak 4); L-色氨酸则为[275, 350] 、 [220, 350] nm, 记为峰5和峰6(Peak 5, Peak 6)。 三种有机物的荧光峰位置和荧光区域形状都很相似, 难以分辨。

图2 (a)吲哚、 (b)3-甲基吲哚和(c)L-色氨酸的三维荧光光谱Fig.2 EEMs of (a) indole: 5×10-4 mmol·L-1, (b) 3-methylindole: 5×10-4 mmol·L-1, (c) L-tryptophan: 1×10-3 mmol·L-1

相同浓度下, 三种有机物在激发波长为275～280 nm处的最高荧光强度(峰1、 峰3和峰5)依次为: 吲哚>3-甲基吲哚>L-色氨酸。 结构相近的荧光有机物, 虽然三维荧光光谱相似, 但荧光峰强度却有显著差异, 借助三维荧光光谱技术进行分析时, 一旦误判了物质种类, 也会对荧光有机物浓度的测量造成严重影响。 因此, 迫切需要探寻更精确有效的荧光有机物识别方法, 以提高对于三维荧光光谱相似的荧光有机物识别的准确度。

2.2 荧光量子产率

紫外-可见吸收光谱(图3)显示, 吲哚的最大吸收峰在约275 nm处; 3-甲基吲哚和L-色氨酸的最大吸收峰在约280 nm处。 以上述最大吸收峰波长作为激发波长分别对3种有机物的荧光量子产率进行检测。

图3 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的紫外-可见吸收光谱(c=0.01 mmol·L-1)Fig.3 UV-Vis absorption spectra of indole, 3-methylindole and L-tryptophan (c=0.01 mmol·L-1)

测试结果显示(表1), 浓度为0.01 mmol·L-1时, 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的荧光量子产率分别为0.264、 0.347和0.145。 荧光量子产率是表证荧光有机物发光效率的重要参数, 数值越大则有机物荧光越强。 它主要决定于有机物的结构, 同时也与有机物所处的微环境有关[7]。 实验结果揭示虽然三种有机物具有相同的吲哚发光团, 但取代基的不同给发光效率带来了显著影响, 表现为荧光量子产率数值的上升或下降。

表1 吲哚、 3-甲基吲哚、 L-色氨酸量子产率Table 1 The quantum yields of indole, 3-methylindole and L-tryptophan

表2 吲哚、 3-甲基吲哚、 L-色氨酸溶液的荧光寿命(c=0.1 mmol·L-1)Table 2 The fluorescence lifetime of indole, 3-methylindole and L-tryptophan (c=0.1 mmol·L-1)

3-甲基吲哚和L-色氨酸均是吲哚的取代产物, 且取代基的位置相同, 但取代基的性质有较大差异。 甲基(-CH3)为饱和烃基, 给电子基团。 有研究表明, 甲基能改变荧光体的共轭π电子云的空间布局, 降低分子基态激发能, 从而提高取代产物的荧光量子产率, 同时, 甲基的引入, 也会导致EX和EM的红移[8]。 本实验结果显示, 在相同条件下, 相比于吲哚, 3-甲基吲哚荧光量子产率提升了31.44%, 荧光峰EX红移了5 nm, EM红移了20 nm, 符合前述已有的研究结果。 L-色氨酸的取代基团含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH), 其中氨基为给电子基团, 羧基为得电子基团。 一般来说, 给电子取代基能提高荧光效率, 而得电子取代基则会使荧光效率降低。 本实验结果显示, 在相同条件下, 相比于吲哚, L-色氨酸荧光峰的EX和EM变化不明显, 但荧光量子产率显著下降了45.08%。 一方面, 可能是羧基的影响力较氨基更强, 使取代基整体呈现为得电子基团的性质, 从而降低了荧光效率; 另一方面, 分子激发态势能面上存在着锥形交叉点[9], 氨基靠近吲哚环处形成氢键, 可能使得处在激发态的L-色氨酸分子更容易到达锥形交叉点而返回基态, 从而促进非辐射跃迁速率。 两种因素叠加, 造成L-色氨酸荧光量子产率大幅度降低。

2.3 荧光寿命

吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸溶液的时间分辨荧光光谱如图4所示, 其中纵坐标为检测到的光子数量, 横坐标为时间。 对时间分辨光谱的荧光衰减曲线进行拟合计算可以得到三种有机物的荧光寿命τ和其不同分子构象的指前因子B。 通过比较拟合方差χ2, 发现双指数方程拟合效果更好, 但是其指前因子B1小于零, 与实际不符, 因此, 可以判断本次实验中使用的吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸溶液中均只存在一种主要的构象, 荧光寿命分别为4.149 2、 7.895 7和2.715 1 ns。

图4 时间分辨荧光光谱(c=0.1 mmol·L-1)Fig.4 Time-resolved fluorescence spectra (c=0.1 mmol·L-1)

同时, 使用0.05和1 mmol·L-1的吲哚、 3-甲基吲哚、 L-色氨酸溶液进行荧光寿命的测定, 测试条件和拟合情况与前述实验保持一致, 得到三种有机物不同浓度下的时间分辨光谱(图5)。

图5 不同浓度下的时间分辨荧光光谱(a): 吲哚; (b): 3-甲基吲哚; (c): L-色氨酸Fig.5 Time-resolved fluorescence spectra at different concentrations(a): Indole; (b): 3-methylindole; (c): L-tryptophan

表3列出了不同浓度下三种溶液的荧光寿命, 结果显示, 吲哚和3-甲基吲哚溶液在三种浓度下的荧光寿命排序为:τ1>τ0.1≈τ0.05; L-色氨酸溶液则稳定在2.70 ns附近。 吲哚和3-甲基吲哚溶液在1 mmol·L-1浓度时的荧光寿命相比0.1 mmol·L-1浓度时分别上升了12.37%和15.66%。 溶液浓度较高时, 由于内滤效应存在, 使得到达有机物分子的激发光强度或到达检测器的发射光强度降低, 前者是由于基态分子对入射光的吸收, 后者则是由于基态分子对发射光的吸收, 分别称为初级和次级内滤效应[10]。 初级内滤效应会降低有机物发射光谱的总体强度, 但不会改变荧光光谱的形状和荧光峰位置, 也不会改变高浓度下有机物的荧光寿命值, 因此在对荧光寿命进行分析时, 可忽略初级内滤效应的影响。 次级内滤效应可能会使荧光发射光谱的形状和荧光峰位置发生畸变, 其作用机制本质上是荧光的自吸收效应[11]。 从前文可知, 吲哚和3-甲基吲哚的荧光发射光谱和吸收光谱有一定的重叠, 且荧光量子产率较高, 荧光在比色皿中的行程距离内更易被溶液中处于基态的分子部分吸收后再次发射荧光, 这种自吸收导致的二次发光甚至多次发光现象使得表观荧光寿命变长。 随着浓度增大, 多次发光比例增多, 检测得到荧光寿命值就愈大[12]。

表3 不同浓度下吲哚、 3-甲基吲哚、 L-色氨酸溶液的荧光寿命Table 3 The fitting results of fluorescence lifetime of indole, 3-methylindole and L-tryptophan at different concentrations

3 结 论

研究了吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的三维荧光光谱、 荧光量子产率和荧光寿命。 浓度为0.01 mmol·L-1时, 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的量子产率分别约为0.264、 0.347和0.145, 浓度为0.1 mmol·L-1时, 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的荧光寿命分别约为4.149、 7.896和2.715 ns。 吲哚、 3-甲基吲哚和L-色氨酸的三维荧光光谱形状相似, 难以准确区分, 但其荧光量子产率和荧光寿命展现出明显的差异。 本研究结果初步表明, 荧光寿命和量子产率有潜力应用于荧光有机物的精确区分, 为有机物的识别与鉴定提供了一种新的方法。