微生物学快速现场评价在重症肺炎中的应用价值

杨幸乐 夏婷婷 左春磊 史家欣

1锦州医科大学（辽宁锦州 121000）；徐州医科大学附属连云港医院2呼吸与危重症医学科，3检验科（江苏连云港 222006）

重症肺炎是重症监护病房内的一种常见急危重症，多见于免疫功能低下的患者，临床上常表现为病情重、进展迅速、治疗难度大、预后差等特征，严重威胁人类健康［1］。尽管目前在病因调查和抗微生物治疗方面已取得较大进展，但重症肺炎仍然是全世界感染死亡的主要原因之一［2］。有调查研究［3］表明，在没有可靠的致病微生物证据的情况下，仅接受经验性治疗的患者病死率高达30% ～50%，及时有效的靶向抗菌药物治疗是提高重症肺炎患者生存率的有效手段。微生物学快速现场评估（M-ROSE）是指利用现场制片、染色手段并在较短时间内获取微生物学证据的一项检测技术［4-5］。有研究［6-7］证明M-ROSE 对肺部感染患者具有较高的诊断价值，但对于M-ROSE 在重症肺炎中的应用价值尚未明确。本研究通过观察M-ROSE 对重症肺炎患者入院后临床症状、血炎症指标水平、机械通气时间、住ICU 时间及病死率的影响，评价M-ROSE 在重症肺炎中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料随机选取2021 年2 月至2023 年2 月在连云港市第一人民医院住院的60 例重症肺炎患者，其中M-ROSE组30例、对照组30例。MROSE 组患者利用M-ROSE 检测结果选取抗菌治疗方案，而对照组则依据指南选择经验性抗菌治疗方案。本研究已获得连云港市第一人民医院伦理委员会审批（伦理审查意见号：KY-20211027001）。

1.1.1 入组标准年龄≥18 岁；入院后初诊为重症肺炎尚未使用抗菌药物治疗；符合2007 年美国感染疾病学会/美国胸科学会关于重症肺炎诊断标准的住院患者［8］。重症肺炎主要标准：患者需行有创机械通气治疗；脓毒性休克需血管收缩剂治疗。次要标准：呼吸频率＞ 30 次/min；氧合指数（PaO2/FiO2）＜ 250；多肺叶浸润；意识障碍／定向障碍；氮质血症（BUN ＞ 20 mg/dL）；由感染引起的白细胞减少（WBC ＜ 4.0 × 109/L）；血小板减少（血小板 ＜ 100 × 109/L）；低体温（T ＜ 36 ℃）；低血压，需要进行积极的液体复苏治疗。符合1项主要标准或3项次要标准可诊断为重症肺炎。

1.1.2 排除标准合并有肺纤维化、免疫性疾病、长期使用激素的患者；自身免疫性疾病患者；先天性免疫缺陷、获得性免疫缺陷患者；晚期肿瘤患者。

1.2 方法

1.2.1 资料收集收集入组患者临床、实验室及相关影像学资料，包括患者基础信息、既往史、血清炎症指标（细胞因子、WBC、CRP）、发热时长、机械通气时间、住ICU 时长、28 d 病死率。住院后首次诊断重症肺炎日期即为观察起始日期，每天对患者治疗效果进行评价，肺炎已控制且生命体征平稳者予转出ICU。所有入组患者均由本人或委托人签署知情同意书（版本号：V1.2021.01.27）。

1.2.2 气道分泌物及肺泡灌洗液收集对于意识清醒，有自主排痰能力的入组患者，嘱咐患者主动咳痰，收集深部痰标本；对于无自主排痰能力和有创机械通气者予吸痰器吸引深部痰液，并予以送检下一步检测；接受电子支气管镜检查行支气管肺泡灌洗者，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），留取部分BALF 送检验科行病原学检测，其余BALF行M-ROSE 检测。

1.2.3 标本染色

1.2.3.1 革兰氏染色对收集到的痰液和BALF进行现场快速涂片，对于痰液丰富者，予0.1%DTT进行祛痰处理，再吸取20 μL 标本进行涂片，自内向外划直径为1 cm 的同心圆薄层，将标本至于酒精灯上加热固定。（1）滴加80 μL 结晶紫进行初染，时间1 min；（2）流水冲洗后，滴加80 μL 碘液进行媒染，时间1 min；（3）流水冲洗后滴加95%乙醇进行脱色，时间20 s ；（4）无需冲洗，直接滴加80 μL 沙黄复染，时间1 min；（5）染好的涂片用细小流水冲洗，尽量减少沉渣沉积，避免流水直接冲洗玻片，将洗净的涂片片尾朝上，待涂片自然晾干后镜检，滴加香柏油在油镜下观察。若视野中出现紫色球（杆）状细菌，则为革兰阳性球（杆）菌；若视野中出现红色球（杆）菌，则为革兰阴性菌球（杆）菌。

1.2.3.2 抗酸染色取标本混悬液20 μL，在洁净的载玻片上由内向外均匀涂抹直径为1 cm 的同心圆薄层，将标本至于酒精灯上加热固定；（1）滴加石碳酸复红初染（3 min，弱火）；（2）水洗后，3%盐酸乙醇脱色（20 s，2 次）；（3）水洗后，亚甲蓝复染（1 min），染好的涂片用细小流水冲洗，尽量减少沉渣沉积，避免流水直接冲洗玻片，将洗净的涂片片尾朝上，待涂片自然晾干后镜检。若视野中出现红色细长，略弯曲的杆菌，则为结核杆菌。

1.2.3.3 真菌涂片镜检接种环取标本混悬液，涂抹于洁净载玻片上，滴加10%的氢氧化钾溶液处理后在低倍镜和高倍镜下观察有无孢子或菌丝，注意操作过程尽可能在无菌环境终完成，以此减少假阳性的发生率。若真菌涂片见孢子或菌丝，可进一步完成墨汁染色，判断是否为隐球菌感染。

1.2.4 抗菌治疗方案的选择M-ROSE 组患者的初始抗菌药物治疗方案根据镜检结果，结合《抗菌药物临床应用指南（第三版）》选择相应的抗感染治疗方案。对照组患者根据《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018 年版）》、《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016 年版）》指南结合临床选择经验性抗感染治疗方案［9-10］。

1.2.5 血清细胞因子的测定抽取所有受试者在诊断后的第1、7 天清晨空腹静脉血3 mL，以3 000 r/min，4 ℃离心15 min，分离血清，应用流式荧光法（CBA）检测血清中细胞因子IL-6、IL-10 的水平，操作过程严格按说明书进行。

1.2.6 临床观察指标及疗效判定标准对两组患者病程第1、7 天炎症指标（WBC、CRP）进行观察比较，并比较两组患者发热消失时长、机械通气时间、住ICU 时长及28 d 病死率的差异。

1.3 统计学方法利用SPSS 19.0 软件进行数据处理，非正态计量资料数据以中位数和四分位数（Q1/Q3）表示；正态计量资料数据以均数±标准差表示，两组间均数的比较采用独立样本t检验，计数资料以例表示，采用χ2检验。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料两组患者性别、年龄、临床症状（发热、呼吸困难）、慢性病史、吸烟史、APACHEⅡ评分，差异无统计学意义（P＞ 0.05），有可比性。见表1。

表1 两组患者一般资料Tab.1 Comparison of general data of patients between the two groups

2.2 M-ROSE 结果30 例患者的M-ROSE 评估结果显示，革兰阳性菌为5 例（16.67%，涂片结果如图1A），革兰阴性菌为11 例（36.67%，涂片结果如图1B），结核1 例（3.70%，涂片结果如图1C）；真菌3 例（10%，涂片结果如图1D）；混合感染10 例（33.33%）。

图1 M-ROSE 涂片Fig.1 M-ROSE smear

2.3 血清IL-6、IL-10 水平变化应用CBA 法检测入组患者第1、7 天血清中细胞因子IL-6、IL-10的表达，并计算IL-6/IL-10 比值。第1 天两组IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 水平无明显差异（P＞ 0.05），治疗7 d 后M-ROSE 组IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 水平均较对照组显著下降（P＜ 0.05）。见表2。

表2 两组患者血清细胞因子水平的动态变化与比较Tab.2 Comparative analysis of serum cytokine levels and their dynamic changes between the two groups ±s

表2 两组患者血清细胞因子水平的动态变化与比较Tab.2 Comparative analysis of serum cytokine levels and their dynamic changes between the two groups ±s

注：#中位数和四分位数

细胞因子IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）IL-6/IL-10 P值0.143 0.001 0.849 0.011 0.249 0.001天数第1天第7天第1天第7天第1天第7天M-ROSE组119.04 ± 46.79 34.85（29.14，44.76）#1.89 ± 0.66 1.86 ± 0.55 66.94 ± 28.77 21.08 ± 4.63对照组139.38 ± 58.62 74.17（63.14，95.31）#1.92 ± 0.60 2.27 ± 0.65 75.86 ± 30.46 33.97 ± 6.07统计量值1.486 8.271 0.191 2.638 1.166 9.242

2.4 血清WBC和CRP水平变化入院时M-ROSE组和对照组患者血清WBC、CRP 水平比较差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表3。治疗1 周后两组患者血清WBC、CRP 水平均较前下降，M-ROSE 组和对照组患者血清WBC、CRP 水平差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表3。

表3 两组患者血清炎症指标水平的变化与比较Tab.3 Dynamic alterations and comparative analysis of serum inflammatory biomarkers between the two groups ±s

表3 两组患者血清炎症指标水平的变化与比较Tab.3 Dynamic alterations and comparative analysis of serum inflammatory biomarkers between the two groups ±s

血炎症指标WBC（× 109个/L）CRP （mg/L）天数第1天第7天第1天第7天M-ROSE组11.71 ± 2.50 8.86 ± 1.22 99.00 ± 43.74 74.93 ± 28.60对照组11.07 ± 1.93 9.58 ± 1.34 106.50 ± 39.09 93.05 ± 27.05统计量值1.118 2.182 0.701 2.521 P值0.268 0.033 0.486 0.014

2.5 患者发热时间对照组患者发热时间是（4.17 ± 1.70）d，M-ROSE 组是（2.87 ± 1.53）d，MROSE 组显著少于对照组，两组比较差异有统计学意义（t= 3.114，P= 0.003）。

2.6 机械通气时间M-ROSE 组（n= 14）和对照组（n= 16）机械通气时间分别是（4.21 ± 1.48）d 和（7.31 ± 2.72）d，M-ROSE 组机械通气时间显著低于对照组，两组比较差异有统计学意义（t= 4.355，P＜ 0.05）。

2.7 住ICU 时长M-ROSE 组和对照组住ICU 时长分别是（11.77 ± 1.52）、（12.80 ± 1.75） d，M-ROSE组显著低于对照组，两组比较差异有统计学意义（t= 2.439，P= 0.018）。

2.8 28 d 病死率M-ROSE 组死亡2 例（6.67%），对照组死亡1 例（3.33%），两组比较差异无统计学意义（χ2= 0.351，P= 0.554）。

3 讨论

重症肺炎作为ICU 内常见的急危重症，其治疗难度大，病死率高，常有多种合并症，极大增加了医疗保健负担［1］。如何改善重症肺炎预后一直是国内外研究的热点之一［11］。尽早确定病原体并进行针对性治疗是改善重症肺炎患者预后的关键措施之一［12］。近年来随着各类介入与微创技术的飞速发展，快速染色制片技术不断提升，基于介入技术的M-ROSE 优势愈发明显，并逐渐成为现代介入呼吸病学和呼吸与危重症医学的核心技术之一［7，13-14］。既往有研究［6］将M-ROSE 应用于支气管镜下的肺部感染患者的病原学诊断中，通过回顾性分析评估M-ROSE 的诊断敏感性和特异性，初步证明了M-ROSE 在支气管镜下对肺部感染患者具有较高的诊断价值，有助于对感染患者进行病原学的初步评估，为下一步的临床治疗提供早期病原学依据，及早开始使用合适的抗菌药物是减少重症肺炎患者不良后果的关键因素［11］。

众所周知，促炎反应与抗炎反应之间的平衡在重症肺炎病程及转归中发挥着至关重要的作用。IL-6 作为促炎因子中的重要成员，在细胞间信号传递以及杀灭病原菌方面具有显著意义，但其过度表达则会加重组织损伤导致不良预后［15］。而IL-10 是抑制炎症反应、限制过度免疫反应的重要抗炎介质［16］。既往研究［17］表明，降钙素原（PCT）在细菌感染引起的促炎症反应刺激下水平会升高，是一种鉴别细菌与非细菌感染的有用指标，但在新冠肺炎中进行的一项研究发现PCT 反映全身炎症反应水平的敏感性低于CRP，结果显示无论在轻型组、普通组、重型组或危重组CRP 水平均高于对照组，而PCT 在轻型组和普通组中均与对照组无显著异。因此，CRP 能更好地反映全身炎症反应水平并对治疗效果作出快速反应［18］。

本研究通过前瞻性研究本院60 例重症肺炎患者，观察两组患者血液炎症因子水平（如IL-6、IL-10、IL-6/IL-10）、WBC、CRP 以及发热时长、机械通气时间、住ICU 时长、28 d 病死率，评估M-ROSE在重症感染患者中的应用价值。结果显示，治疗7 d 后M-ROSE 组IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 水平均低于对照组（P＜ 0.05）。与对照组相比，M-ROSE组患者的血WBC、CRP 水平下降速度更快（P＜ 0.05），发热症状持续时间更短（P＜ 0.05），机械通气时间和住ICU 时长明显缩短（P＜ 0.05）。由此可见，依据M-ROSE 检测结果选择抗菌方案可快速有效地改善症状，促进炎症因子和炎症指标水平下降，缩短机械通气时间及住ICU 时间。这些指标的快速改善，得益于M-ROSE 快速提供了初始病原学信息从而尽早选择了更有针对性的抗菌药物。

既往有研究［19］表明，对痰液进行革兰染色可优化医院获得性肺炎抗菌药物的选择，显著降低肺炎患者病死率。而本研究结果显示M-ROSE 组与对照组患者病死率无明显差异（P＞0.05），究其原因可能在于本研究纳入的样本量较小、微生物学鉴别手段较少，未来需要进行多中心、大样本的研究，并纳入更多的微生物检测手段（如真菌免疫荧光检测法、快速病原核酸检测等）及检测标本（如胸水、气管镜活检或针吸活检标本），以此获得进一步的结论。

M-ROSE 操作简单，可行性强，有助于在病原学层面对重症肺炎患者进行初步病原学评估，为重症肺部感染患者的治疗提供初步的病原学参考，对改善重症肺炎预后具有潜在的临床价值。由于过度、不适当使用抗菌药物易导致抗菌药物耐药，尽早、合理使用抗菌药物可极大减少抗菌药物耐药的发生［11，20］。下一步需要探索M-ROSE 指导的抗菌药物治疗与基于指南的经验抗菌药物治疗的耐药性是否存在差异。

【Author contributions】YANG Xingle， XIA Tingting and ZUO Chunlei performed the experiments and wrote the article. SHI Jiaxin revised the article. SHI Jiaxin designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.