乳腺癌患者外周血中颗粒酶B和穿孔素的表达及意义

庄赵为 袁武梅 任作东 李上飞 陈明贵 曾妍，

1石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室（新疆石河子 832002）；2广东医科大学附属湛江中心医院精准医学检验实验室（广东湛江 524037）

乳腺癌的发病率及病死率呈逐年上升的趋势，到2020 年全球约有1 930 万新发癌症病例，乳腺癌成为全球女性最常见的癌症，乳腺癌的癌症相关死亡排名为第五名［1］。2020 年中国约有82 万新发癌症病例，乳腺癌的新发病例数约42 万，成为中国第四大常见癌症［2］。

颗粒酶B 和穿孔素主要表达于细胞毒性T 淋巴细胞（CD8+T）和自然杀伤细胞（NK），在促进肿瘤细胞凋亡方面发挥重要作用。颗粒酶B 介导的凋亡作用通常需要穿孔素的协同，穿孔素首先破坏靶细胞的膜，形成孔道，颗粒酶B 通过孔道进入靶细胞诱导其凋亡［3-6］。颗粒酶B 和穿孔素的检测多数采用免疫组化、ELISA 的方法检测组织或外周的表达量，未涉及具体免疫细胞中的表达情况。

本研究利用流式细胞术检测乳腺良性疾病和乳腺癌患者外周血CD3+T 细胞、CD8+T 细胞及NK细胞中颗粒酶B 和穿孔素的表达情况，旨在探究颗粒酶B 及穿孔素在免疫细胞中的作用及临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2023 年1-6 月在广东医科大学附属湛江中心医院首诊住院治疗的女性乳腺癌患者108 例为肿瘤组，平均年龄（53.31 ± 9.59）岁；收集同期住院70 例女性乳腺良性疾病患者为对照组，平均年龄（38.00 ± 9.52）岁。收集乳腺癌患者外周血并检测T 淋巴细胞亚群及NK 细胞中颗粒酶B 和穿孔素的表达，收集乳腺癌患者雌激素受体（estrogen receptor， ER）、孕激素受体（progesterorne receptor， PR）、人表皮生长因子2（human epidermal growth factor receptor 2， HER-2）、Ki67、分子分型、肿瘤大小、淋巴结转移情况、临床分期等临床资料。收集22 例乳腺癌患者治疗前血样和102 例乳腺癌患者治疗后血样。本研究经广东医科大学附属湛江中心医院伦理委员会审批，所有患者知晓本次研究，伦理审批号：PJ［IIT-2021-007-02］。

1.2 仪器与试剂贝克曼流式细胞仪购自美国Beckman-Coulter 公司，荧光单克隆抗体试剂、溶血剂、固定剂及破膜剂均为青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司。

1.3 实验方法采集患者外周血2 ～ 5 mL，肝素抗凝，在24 h 内尽快检测。流式细胞术检测颗粒酶B 和穿孔素步骤：（1）向管底加入CD45、CD3、CD8、CD16、CD56 试剂25 μL；（2）用微量移液器吸取50 μL 全血加入管底，避免样本碰到管壁；（3）涡旋混匀5 s，室温避光孵育20 min；（4）加入1×溶血剂450 μL，室温避光裂解15 min；350 ×g离心5 min弃掉上清；（5）加入120 μL 固定剂，涡旋后，静置避光孵育20 min；（6）加入1×PBS 缓冲液300 μL，涡旋后，350 ×g离心5 min 后弃掉上清；（7）加入1×破膜剂2 mL，涡旋混匀后，避光孵育20 min 后350 ×g离心5 min 弃掉上清；（8）加入颗粒酶B 或穿孔素抗体10 μL，涡旋后，避光静置20 min；（9）加入1×PBS缓冲液300 μL，打开流式细胞仪上机模板，流式管涡旋后上机检测，检测结果通过流式细胞仪分析软件自动分析获得。以颗粒酶B 或穿孔素阳性率表示颗粒酶B 或穿孔素的表达水平。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料为非正态分布，以中位数表示，两组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用非参数Kruskal-WallisH检验。采用受试者工作特征（ROC）曲线探究诊断价值。统计绘图选用GraphPad Prism 8.0.2 进行制作。P＜ 0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血T 淋巴细胞亚群及NK 细胞中颗粒酶B 与穿孔素阳性率比较肿瘤组CD3+T 细胞、CD8+T 细胞及NK 细胞中颗粒酶B 和穿孔素阳性率均高于对照组，差异有统计学意义（均P＜ 0.05），见图1。

图1 比较肿瘤组和对照组颗粒酶B 和穿孔素的表达水平Fig.1 Comparison of the expression levels of granzyme B and perforin between the tumor group and the control group

2.2 外周血T 淋巴细胞亚群及NK 细胞中颗粒酶B 与穿孔素阳性率诊断乳腺肿瘤ROC 曲线根据ROC 曲线显示，CD3+T 细胞、CD8+T 细胞及NK 细胞中颗粒酶B 与穿孔素阳性率预测乳腺肿瘤良恶性的曲线下面积（AUC）均大于0.5，见表1。对于预测乳腺肿瘤良恶性均具有很好的价值，见图2。

表1 外周血T 细胞和NK 细胞中颗粒酶B 和穿孔素的ROC 曲线Tab.1 ROC curve of granzyme B and perforin in peripheral blood T cells and NK cells

图2 外周血T 细胞及NK 细胞中颗粒酶B 和穿孔素阳性率预测乳腺肿瘤良恶性ROC 曲线Fig.2 ROC curve of granzyme B and perforin positive rate in peripheral blood T cells and NK cells to predict benign and malignant breast tumors

2.3 乳腺癌患者T 淋巴细胞亚群及NK 细胞中颗粒酶B 和穿孔素的表达与临床病理特征的相关分析83 例乳腺癌患者样本中，随着肿瘤增大，CD3+T 细胞和CD8+T 细胞中颗粒酶B 阳性率显著升高（P＜ 0.05）；CD3+T 细胞中穿孔素阳性率也显著升高（P＜ 0.05）。CD3+T 细胞中颗粒酶B 和穿孔素阳性率在淋巴结转移组明显高于未转移组（P＜0.05）。CD3+T 细胞、CD8+T 细胞中颗粒酶B 阳性率在不同TNM 分期差异有统计学意义（P＜ 0.05），此外CD3+T 细胞中穿孔素阳性率在不同TNM 分期中差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表2。

表2 外周血中颗粒酶B 和穿孔素阳性率与临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between the positive rate of granzyme B and perforin in peripheral blood and clinical pathological characteristics

2.4 乳腺癌患者治疗前后外周血中颗粒酶B 和穿孔素阳性率的变化乳腺癌患者治疗后外周血CD3+T 细胞和CD8+T 细胞中颗粒酶B 和穿孔素阳性率均显著高于治疗前，差异有统计学意义（均P＜ 0.05），见表3。

表3 乳腺癌患者治疗前后外周血中颗粒酶B 和穿孔素阳性率的变化Tab.3 Changes of positive rates of granzyme B and perforin in peripheral blood of breast cancer patients before and after treatment

3 讨论

肿瘤免疫是通过全身免疫系统共同调控的［7］，当机体发生癌变时，免疫细胞的数量及功能会发生改变，颗粒酶B 和穿孔素是免疫细胞发挥杀伤功能的关键蛋白。CD3+T 细胞代表总T 细胞水平，CD3+CD8+T细胞为细胞毒性T细胞，CD3-CD16+CD56+细胞为NK 细胞，颗粒酶B 和穿孔素主要表达在细胞毒性T 淋巴细胞和自然杀伤细胞。颗粒酶B 和穿孔素在不同肿瘤中的表达不同，KADIN 等［8］发现在乳房假体周围淋巴瘤中颗粒酶B 的表达高于皮下积液，故颗粒酶B 可以作为一种新的生物标志物，检测恶性淋巴瘤，更好地判断细胞的性质。在非霍奇金淋巴瘤的鉴别诊断中，可用流式细胞术检测颗粒酶B 和穿孔素的表达水平，鉴别T 细胞淋巴瘤和NK 细胞淋巴瘤中的亚型［9］。YUNUSOVA等［10］研究发现，卵巢癌患者外周血NK 细胞中穿孔素和颗粒酶B 的表达高于健康人，故卵巢癌中颗粒酶B和穿孔素的高表达可促进肿瘤的发生发展。CHUNG 等［11］检测肺癌血清中颗粒酶B 含量，发现颗粒酶B 在肺癌患者中低表达，在健康人群中高表达。也有文献报道在结直肠癌肿瘤组织中颗粒酶B 高表达，在正常结肠黏膜组织低表达［12-14］。文献报道主要检测组织、外周血和腹水中总的颗粒酶B 和穿孔素的表达，未对具体细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达进行检测，本研究的创新点在于检测外周血中CD3+T 细胞、CD8+T 细胞和NK 细胞中颗粒酶B 和穿孔素的表达，证明在乳腺癌外周血中，颗粒酶B 和穿孔素主要表达于细胞毒性T细胞和NK 细胞。结果显示，与乳腺良性肿瘤相比，乳腺癌CD3+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞及NK细胞中颗粒酶B 和穿孔素表达均明显升高，其原因是在生理情况下，静止的CD8+T 细胞前体细胞内颗粒酶B 和穿孔素的表达水平低，当机体内发生癌变时，CD8+T 淋巴细胞被激活，释放出大量的颗粒酶B 和穿孔素，诱导肿瘤细胞凋亡［15-16］。

检测T 淋巴细胞亚群及NK 细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达，发现其在乳腺良恶性病变中存在统计学差异，说明这些指标对于乳腺肿瘤良恶性诊断具有价值。通过构建ROC 曲线，发现CD8+T 细胞颗粒酶B 阳性率的AUC 值最大，CD3+T细胞颗粒酶B 的特异性较强，而CD8+T 细胞中颗粒酶B 和穿孔素的灵敏度较高，综合各项数据表明CD8+T 细胞中的颗粒酶B 同时具有较高的灵敏度和特异性，可以作为乳腺癌的协助诊断指标。

病理参数分析结果显示，CD3+T 细胞中颗粒酶B 和穿孔素的表达与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移呈正相关，CD8+T 细胞中颗粒酶B 的表达也与肿瘤大小、肿瘤分期呈正相关。这与YUNUSOVA等［10］的研究结果一致，在结直肠癌外周血中NK 细胞中颗粒酶B 和穿孔素随着肿瘤体积增大和淋巴结侵袭而升高。其原因是颗粒酶B 在诱导肿瘤细胞凋亡过程中，细胞外颗粒酶B 由于未被受体吸收，可能会进入到循环血中。本研究进一步收集乳腺癌患者治疗前后血样，检测外周血中颗粒酶B 和穿孔素的表达，发现乳腺癌患者经治疗后外周血CD3+T 细胞和CD8+T 细胞中颗粒酶B 和穿孔素阳性率高于治疗前，和KADAM 等［17］研究一致，Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌患者化疗后颗粒酶B 的表达量高于化疗前，说明临床治疗有效，有助于临床医生评估乳腺癌的治疗效果。另有文献报道，在结直肠癌的治疗中，新辅助放化疗患者与手术切除组比，CD8+T细胞中颗粒酶B明显增加，总生存期更长［18］。朱月华等［19］研究结果也显示放射疗法联合免疫治疗的宫颈癌患者治疗后外周血单个核细胞中颗粒酶B 和穿孔素的表达量高于治疗前，并显著高于单纯放射疗法组，联合治疗组的1、2 和5 年总生存率高于放疗组，说明联合治疗后颗粒酶B 和穿孔素升高，患者的预后更好。以上文献结果均说明肿瘤患者治疗后颗粒酶B 和穿孔素升高，预后更好。对乳腺癌患者的治疗方案进行分析，发现本研究纳入治疗组分析的乳腺癌患者治疗方案中均包含紫杉醇类药物，紫杉醇类药物对肿瘤具有免疫刺激作用，故治疗后乳腺癌患者外周血中CD3+T 细胞和CD8+T 细胞中颗粒酶B 和穿孔素高表达，可能是由于总T 细胞和细胞毒性T 细胞反应增加［20］。

综合以上结果，乳腺癌患者外周循环血中CD3+T 细胞和NK 细胞中的颗粒酶和穿孔素在乳腺疾病的良恶性诊断中具有参考价值，与肿瘤大小及转移有关，可辅助临床对乳腺癌治疗的评价及预后的判断。本研究仍需改进，可进一步扩大样本量，从而避免存在选择偏倚或者引起研究结果的误差，后续需进一步扩增样本量并对乳腺癌进行分类，继续探究颗粒酶B 和穿孔素的临床价值。

【Author contributions】ZHUANG Zhaowei performed the experiments and wrote the article. YUAN Wumei revised and polished the article.REN Zuodong， LI Shangfei and CHEN Minggui performed data collection and statistical analysis. ZENG Yan designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.