Nrf2 调控PI3K/Akt 信号通路促进肺腺癌进展的机制研究

孙定周 张鑫 朱洁晨 朱述阳

肺癌是全球范围内危害人类健康的常见肿瘤之一，其发病率和病死率均位于恶性肿瘤的首位[1]，而腺癌是其最常见的病理类型[2]。目前，手术是早期肺癌患者的首选且最有效的治疗方式。然而，肺癌的早期症状缺乏典型性，部分患者偶可见咳嗽、痰中带血、消瘦等症状，因此大部分患者一经诊断即处于进展期，预后极差。近年来，关于肺癌的基础及临床研究发展迅速，临床治疗理念不断更新，而靶向治疗联合免疫治疗则有可能为进展期肺癌的治疗带来新希望[3]。因此，探究肺癌细胞内分子表达异常的机制及其在肺癌发展中的作用，对肺癌的分子靶向治疗、改善患者预后具有重要意义。核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是细胞抗氧化反应的主要调节因子，并与DNA 的损伤修复相关，可抑制细胞凋亡[4]。研究发现Nrf2 在多种类型的肿瘤细胞中被异常激活，可促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力并参与肿瘤细胞对放化疗抵抗的过程[5]，表明Nrf2 可能作为一个良好的肿瘤治疗靶标。有研究指出，Nrf2 在肺癌中过表达[6-7]，并与肺癌细胞的恶性生物学行为密切相关[8-10]，但其作用机制目前尚不清楚。因此，本研究通过探讨Nrf2 对肺腺癌细胞增殖、迁移能力的影响，进一步研究Nrf2 促进肺腺癌进展的可能机制，以期为肺癌的靶向治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本收集 收集2020 年10 月至2021 年10月在徐州医科大学附属医院住院并接受手术治疗的30 例肺腺癌患者的癌组织及癌旁组织标本。所有患者术前均未接受过放化疗，经术后病理检查确诊为肺腺癌。本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理委员会审查通过（批准文号：XYFY2022-KL278-01）。

1.1.2 细胞、试剂及仪器 人肺腺癌细胞系A549 细胞购自中科院上海细胞库。FBS（批号：A4766801）、RPMI 1640 培养基（批号：R5158）均购自美国Gibco 公司；Trizol 试剂（批号：15596026）购自美国赛默飞公司；反转录试剂盒（货号：RR014B）、RT-qPCR 试剂盒（货号：RR086B）均购自日本TaKaRa 公司。Nrf2 过表达质粒（vector-Nrf2）及阴性对照质粒（vector）均购自上海吉凯公司；Lipofectamine 2000 转染试剂（批号：C0518）、组织抗原修复液（批号：P0081）、抗体稀释液（批号：P0277）均购自南京碧云天公司；Nrf2 小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）序列、Nrf2 引物均购自上海生工公司；Transwell 小室（货号：3422）购自美国康宁公司；5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU）试剂盒购自上海碧云天公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、Nrf2、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR) 、磷酸化mTOR（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、B 淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2 gene，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体均购自武汉三鹰公司（批号分别为：10494-1-AP、16396-1-AP、60203-2-Ig、80455-1-RR、28273-1-AP、67778-1-Ig、26593-1-AP、50599-2-Ig、20874-1-AP）；VD-850 型生物超净工作台购自苏州净化设备公司；Olympus IX71 型倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；Mini Protean 3 Cell 型BIO-RAD 电泳-转膜仪购自美国伯乐公司；PHY-型病理漂烘仪购自常州市中威电子仪器厂；LM1235 石蜡切片机购自德国Leica 公司；TSJ-Ⅱ型电脑自动组织脱水机购自常州市中威电子仪器厂；JC101 型电热鼓风干燥箱购自上海成顺仪器仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺腺癌组织及癌旁组织中Nrf2 蛋白表达分布检测 采用免疫组化法。在徐州医科大学附属医院病理科完成组织标本的石蜡包埋、切片（厚度4 μm）过程。切片经过脱蜡、梯度乙醇水化、修复抗原、漂洗后，加入内源性过氧化酶阻断试剂，漂洗后封闭，然后滴加Nrf2 一抗（稀释比例1∶300），室温孵育后漂洗，滴加二抗并孵育，漂洗后DAB 染色、苏木素复染、冲洗。随后将切片梯度脱水，透明并封片，室温下放置约5 d 后用倒置荧光显微镜摄片，随机挑选5 个视野拍摄，使用Image Pro Plus 软件计算图片的累计光密度/区域面积（integral optical density/area，IOD/Area）值。

1.2.2 肺腺癌组织及癌旁组织中Nrf2 mRNA 表达水平检测 采用RT-qPCR法。使用Trizol试剂提取总RNA，按照说明书的实验步骤将mRNA 反转录成cDNA，随后通过RT-qPCR 法检测Nrf2 mRNA 表达水平。采用2-ΔΔCt法评估目的基因Nrf2 的相对表达水平，GAPDH 作为内参基因。引物序列见表1。总反应体系20 μL，其中ddH2O 6.4 μL，SYBR Green 10 μL，cDNA 2.0 μL，正反向引物各0.8 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min，共40 个循环。实验重复3 次。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.2.3 细胞培养和分组 将A549 细胞培养于含10%FBS、无青链霉素的RPMI 1640 培养基中，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。A549 细胞传代培养至第4代，融合度达到70%时随机分为Nrf2 过表达组（vector-Nrf2 组）、过表达阴性对照组（vector 组）、Nrf2 沉默表达组（si-Nrf2 组）和沉默表达阴性对照组（si-NC组）。使用Lipofectamine 2000 转染试剂将5 μg 的vector-Nrf2、vector 以及siRNA 沉默序列、阴性对照序列分别转染到A549 细胞，转染6 h 后更换培养基，在正常条件下培养24 h 后裂解细胞提取蛋白样本，使用Western blot 法检测转染效果。

1.2.4 细胞迁移能力检测 采用Transwell 法。在转染vector-Nrf2、siRNA 沉默序列的24、48 h 后，消化、重悬A549 细胞并调整密度为1×105/mL，吸取200 μL 重悬液接种在Transwell 上层小室内，并向下层小室中添加800 μL 含有10%FBS 的培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h 后取出。吸弃上室中的培养液，医用棉签蘸水后轻柔擦拭上室内侧未迁移的细胞，用PBS 清洗3 次后用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色15 min，双蒸水漂洗干净后倒扣在超净台内风吹晾干，在倒置荧光显微镜下拍照，使用Image J 软件计算迁移至小室底层的细胞数。

1.2.5 细胞增殖能力检测 采用EdU 荧光计数法。重悬A549 细胞并调整密度为1×104/mL，吸取100 μL/孔重悬液接种至96 孔板内培养16 h，按照产品使用说明书进行染色操作。倒置荧光显微镜下分别拍摄同一视野下的红色荧光（EdU 阳性细胞）和蓝色荧光（所有细胞核），使用Image J 软件分别计算红蓝色细胞总数，细胞EdU 阳性率与细胞增殖能力呈正相关关系，通过计算细胞EdU 阳性率检测细胞增殖能力。

1.2.6 细胞及组织标本中Nrf2 及下游磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt 信号通路相关蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液提取总蛋白。使用浓度为10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离目标蛋白质，然后在湿转槽将蛋白转移到甲醇激活的聚偏二氟乙烯膜，1×Tris 盐缓冲液（tris buffered saline，TBST）洗膜5 min 后将膜浸入3%牛血清白蛋白，室温条件下封闭2 h。使用抗体稀释液将各抗体按照以下比例进行稀释：Nrf2（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000），在37 ℃下孵育2 h。GAPDH（1∶3 000）作为内参。再次用TBST 洗膜5 min×3 次后，ECL 发光法检测目标蛋白条带，并使用Image J 软件分析条带灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 9.0 统计软件。计量资料以表示，方差齐时，两组比较采用两独立样本t检验；方差不齐时，两组比较采用Welch'st检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织观测指标结果

2.1.1 肺腺癌组织和癌旁组织中Nrf2 表达的比较肺腺癌组织中Nrf2 阳性表达，主要位于肺腺癌细胞质，见图1。肺腺癌组织中Nrf2 的IOD/Area 值为0.380±0.040，高于癌旁组织的0.020±0.006，差异有统计学意义（t=5.03，P＜0.01）。

图1 Nrf2 在肺腺癌组织和癌旁组织中的表达（A：Nrf2 在癌旁组织中阴性表达；B：Nrf2 在肺腺癌组织阳性表达）

2.1.2 肺腺癌组织和癌旁组织Nrf2 mRNA 表达水平比较 肺腺癌组织中Nrf2 mRNA 表达水平为2.63±0.07，高于癌旁组织的1.00，差异有统计学意义（t=40.33，P＜0.01）。

2.1.3 肺腺癌组织和癌旁组织Nrf2 蛋白表达水平比较 与癌旁组织比较，肺腺癌组织中Nrf2 蛋白表达水平为2.30±0.41，高于癌旁组织的1.04±0.27，差异有统计学意义（t=6.18，P＜0.05），见图2。

图2 肺腺癌组织和癌旁组织Nrf2 蛋白表达的电泳图

2.2 细胞观测指标结果

2.2.1 Nrf2 过表达或Nrf2 沉默对A549 细胞迁移能力的影响 vector-Nrf2 组迁移细胞数为（574.00±40.90）个/孔，高于vector 组的（409.00±11.70）个/孔，差异有统计学意义（t=15.52，P＜0.05），见图3（插页）。si-Nrf2 组迁移细胞数为（218.00±29.55）个/孔，低于si-NC 组的（427.70±27.15）个/孔，差异有统计学意义（t=8.44，P＜0.05），见图4（插页）。

图3 Nrf2 过表达对A549 细胞迁移能力的影响（A：vector 组；B：vector-Nrf2 组）

图4 Nrf2 沉默对A549 细胞迁移能力的影响（A：si-NC 组；B：si-Nrf2 组）

2.2.2 Nrf2 过表达或Nrf2 沉默对A549 细胞增殖能力的影响 vector-Nrf2 组细胞EdU 阳性率为（38.87±0.50）%，高于vector 组的（28.60±0.95）%，差异有统计学意义（t=38.50，P＜0.01），见图5（插页）。si-Nrf2 组细胞EdU 阳性率为（23.23±1.55）%，低于si-NC 组的（34.37±1.60）%，差异有统计学意义（t=6.32，P＜0.05），见图6（插页）。

图5 Nrf2 过表达对A549 细胞增殖能力的影响

图6 Nrf2 沉默对A549 细胞增殖能力的影响

2.2.3 转染过表达质粒或siRNA 沉默片段对A549 细胞Nrf2 蛋白表达水平的影响 vector-Nrf2 组细胞Nrf2蛋白表达水平为1.68±0.29，高于vector 组的0.92±0.17，差异有统计学意义（t=3.83，P＜0.05），见图7。si-Nrf2 组Nrf2 蛋白表达水平为0.52±0.09，低于si-NC组的1.06±0.13，差异有统计学意义（t=19.00，P＜0.01），见图8。

图7 Nrf2过表达对A549细胞Nrf2蛋白表达水平影响的电泳图

图8 Nrf2 沉默对A549 细胞Nrf2 蛋白表达水平影响的电泳图

2.2.4 Nrf2 过表达对细胞PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达的影响 vector-Nrf2 组中p-Akt、p-mTOR、Bcl-2蛋白表达水平均高于vector 组，而Bax、E-cadherin 蛋白表达水平均低于vector 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而两组Akt、mTOR 蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2 和图9。

表2 Nrf2 过表达对细胞内PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达的影响

图9 Nrf2 过表达对细胞PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达水平影响的电泳图

2.2.5 Nrf2 沉默对细胞PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达的影响 si-Nrf2 组中p-Akt、p-mTOR、Bcl-2 蛋白表达水平均低于si-NC 组，而Bax、E-cadherin 蛋白表达水平均高于si-NC 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而两组Akt、mTOR 蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3 和图10。

表3 Nrf2 沉默对细胞PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达的影响

图10 Nrf2 沉默对细胞PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达水平影响的电泳图

3 讨论

肿瘤的发病机制复杂，涉及到遗传、环境、基因突变、免疫微环境改变等诸多因素。近年来关于肺癌的研究发展迅速，临床治疗理念不断更新。随着吉非替尼、阿帕替尼、奥替雷斯及帕博利珠单抗等分子靶向、免疫药物的临床应用，肺癌患者的预后已经得到了初步的改善，但肺癌的病死率仍较高。因此，寻找有价值的分子标志物有助于揭示肺癌发展的分子机制，从而改善患者预后。

Nrf2 是细胞内调控氧化应激反应的重要元件。近年来研究表明，Nrf2 在多种肿瘤中过表达，并能促进肿瘤细胞的增殖和转移[11-12]，但其促进肿瘤进展的机制尚不完全清楚。本研究通过RT-qPCR 法、Western blot法、免疫组化法发现肺腺癌组织中Nrf2 mRNA、蛋白表达水平均高于癌旁组织，表明Nrf2 在肺癌的发展过程中可能发挥着不可忽视的作用。肿瘤的发展与肿瘤细胞的无限增殖、侵袭和转移密切相关。因此，本研究体外培养了A549 肺腺癌细胞，将Nrf2 过表达质粒、si-RNA 沉默片段瞬时转染至细胞内，通过EdU、Transwell 实验证明Nrf2 促进肺腺癌细胞迁移、增殖的能力。PI3K/Akt 信号通路是肿瘤研究中的经典信号通路，其异常激活可显著促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭[12-14]，目前该信号通路抑制剂Copanlisib 可显著提高滤泡性淋巴瘤患者的预后[15]。本研究结果表明，Nrf2沉默可抑制A549 细胞内的PI3K/Akt 信号通路，使其相关蛋白p-mTOR、p-Akt 蛋白表达水平降低，Nrf2 过表达则可促进该信号通路的激活。研究表明，Bcl-2、Bax、E-cadherin 作为PI3K/Akt 信号通路的下游分子[16-17]，受到多种上游蛋白调控，进而影响细胞的凋亡、迁移、侵袭能力[18]。本研究中Nrf2 沉默后的A549细胞内的Bcl-2 蛋白表达水平降低，而Bax、E-cadherin蛋白表达水平升高，而Nrf2 过表达后上述分子的蛋白表达水平则相反。

本研究结果在一定程度上验证了Nrf2 在肺癌进展中发挥的作用，进一步阐明了其作为肺癌治疗靶点潜在可行性。之前的研究表明Nrf2 具有抗氧化剂氧化作用，可以保护细胞抵抗内源性和外源性氧化应激，减轻细胞损伤[19]。本研究体外实验则表明Nrf2 可以增强肺腺癌细胞的增殖和迁移能力，在肿瘤的恶化进展中发挥重要作用。有文献表明Nrf2 的生物学作用可能会在癌组织中发生改变，主要体现在相关信号通路的过度激活，这可能与Nrf2 蛋白翻译后修饰形式不同有关[20-23]。例如有研究报道Nrf2 的翻译后修饰在细胞癌变过程中发挥重要调节的作用，证据表明翻译后修饰可以影响Nrf2 信号转导，Neh1 结构域的p300/CREB 结合蛋白对Nrf2 的乙酰化促进其与ARE 蛋白的结合[20]。在肺腺癌细胞中，下调Nrf2 的乙酰化可导致氧化应激水平增加并激活JNK 信号通路，进而促进肺癌细胞的侵袭[21-23]。而本研究结果则表明Nrf2 的高表达促进了下游Akt 和mTOR 蛋白磷酸化，表明Nrf2 可能通过非自身蛋白修饰途径促进肿瘤进展，虽然目前的证据表明Nrf2 翻译后修饰可以上调其在癌症中的表达，但每种修饰在不同癌症类型中的确切功能、相关性和丰度需要进一步阐明。由于Nrf2 在正常或癌变细胞中扮演不同角色，这提示产生这种现象的分子机制可能是未来的研究方向。

综上所述，Nrf2 在肺腺癌组织中过表达，可能通过调控PI3K/Akt 信号通路，进而调控Bcl-2、Bax、E-cadherin 的表达而影响肺腺癌细胞的增殖、迁移能力，有可能成为一个潜在的分子靶标用于肺腺癌的治疗。