长链非编码RNA Hotair 在CKD小鼠肾脏纤维化中的作用及机制研究

刘琳 任燕 陈茂盛 王敏敏

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是由多种疾病引起的慢性肾脏结构与功能不可逆损害的共同终点。CKD 的共同病理表现是肾脏纤维化，其特点是肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化[1]。在各种病因导致的CKD 背景下，肾小管上皮细胞合成细胞因子、活性氧等大量炎症产物，招募炎症细胞至肾间质并启动与间质成纤维细胞的相互作用。随着间质纤维化的发展，损伤的肾小管上皮细胞失去再生能力并发生凋亡从而导致肾小管萎缩和无功能肾小球的形成[2]。目前延缓肾脏纤维化的治疗手段十分有限。2007 年Rinn 等[3]首先通过微阵列分析发现长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）Hotair 位于第12条染色体上，长度约为2.2 kb。Hotair 参与调控多种生物学行为，如细胞周期的调控、细胞迁移、上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、肿瘤进展等[4]。Yu 等[5]研究表明Hotair 在肝纤维化中表达增加，可能参与肝纤维化的调控，但是其在肾脏纤维化中的作用还不是十分清楚。表观遗传修饰在肾脏纤维化中发挥重要作用[6]。多梳抑制复合体2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是一种重要的染色质修饰复合物，由包括胚胎外胚层发育蛋白（embryonic ectoderm development，EED）、Zeste12 同源物抑制因子（suppressor of Zeste 12 homolog，SUZ12）、Zeste增强子同源物2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）的核心亚基及其他辅助因子组成[7]。既往研究发现Hotair 可与PRC2 及赖氨酸特异性去甲基化酶1（histone lysine-specific demethylase 1，LSD1）结合，从而作为分子支架协调PRC2 和LSD1 靶向染色质进行表观遗传调控[8]。本研究通过在CKD 小鼠模型中干扰lncRNA Hotair 的表达，以探究其在肾脏纤维化中的作用及机制，为寻找新的肾脏纤维化治疗方法提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性SPF 级C57BL/6J 小鼠36 只，购自上海斯莱克实验动物有限公司。小鼠予12 h光照-12 h黑夜循环，自由饮食和饮水，隔日换垫料。本研究经本院医学伦理委员会审查通过（批准文号：2017KT041）。

1.2 试剂和仪器 RNA 提取试剂盒（货号：AG21024）购自中国艾科瑞生物公司；反转录试剂盒（货号：R333）购自南京诺唯赞公司；qRT-PCR 试剂盒（货号：RK21203）购自武汉ABclonal 公司。SUZ12（货号：ab175187，兔抗）、LSD1（货号：ab129195，兔抗）、EZH2（货号：ab307646，兔抗）、EED（货号：ab240650，兔抗）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（货号：ab5831，兔抗）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）（货号：ab231303，兔抗）、胶原蛋白1A1（collagen Ⅰα1，COL1A1）（货号：ab260043，兔抗）、胶原蛋白4A1（collagen Ⅳα1，COL4A1）（货号：ab6586，兔抗）抗体均购自英国Abcam 公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（货号：AF7021，兔抗）和羊抗兔二抗（货号：S0001）均购自美国Affinity 公司；肌酐检测试剂盒（货号：EKF60677）购自加拿大Biomatik 公司；尿素氮检测试剂盒（货号：BC1535）购自中国索莱宝公司。Varioskan LUX 多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher 公司；VeritiPro PCR 仪和ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪购自美国Applied Biosystems 公司；DM IL LED 倒置显微镜购自德国Leica 公司；FluorChem E 成像系统购自美国Bio-Techne公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制备、分组与处理 小鼠适应性饲养1 周后，采用随机数字表法分为对照组、CKD 组、CKD+短发夹RNA-对照（hort hairpin RNA-control，sh-Ctrl）组、CKD+短发夹RNA-Hotair（short hairpin RNA-Hotair，sh-Hotair）组4 组，每组9 只。对照组喂食正常饲料，CKD 组、CKD+sh-Ctrl 组、CKD+sh-Hotair 组均予0.2%腺嘌呤饲料喂养造模，造模6 周后进行下一步处理。CKD+sh-Ctrl 组和CKD+sh-Hotair 组分别予尾静脉注射100 μL（1011基因拷贝）包装了对照shRNA 和HotairshRNA 的腺相关病毒，对照组和CKD 组予尾静脉注射100 μL 0.9%氯化钠注射液。

1.3.2 标本留取 小鼠造模6 周后开始每周测量1 次体重，观察8 周后予水合氯醛麻醉，经心脏取血0.8～1.0 mL，室温析出血清后，3 000 r/min 离心10 min，取上层血清。颈椎脱位法处死小鼠后进行解剖，迅速取出小鼠肾脏，去除肾包膜。取1/4 肾组织清洗后以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片行后续HE 染色和Masson 染色。取1/4 肾组织，将肾皮质液氮冷冻研磨提取RNA。另1/2 肾组织，取肾皮质保存于-80 ℃冰箱提取蛋白行后续检测。

1.3.3 肌酐水平检测 根据肌酐检测试剂盒说明书进行如下操作：配置标准品，加入酶标板。取5 μL 小鼠血清加入待测样品孔中。每孔加入225 μL 酶A 溶液，混合均匀后于37 ℃孵育5 min，酶标仪读取546 nm处的吸光度A1。每孔加入75 μL 酶B 溶液，37 ℃孵育5 min，酶标仪读取546 nm处的吸光度A2。肌酐水平（μmol/L）=样品（A2-A1）/标准品（A2-A1）×标准品浓度。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 尿素氮水平检测 根据尿素氮检测试剂盒说明书进行如下操作：配置尿素氮标准品，将标准品、待测血清样品加入离心管，分别加入试剂一60 μL 和试剂二110 μL，混匀后于37 ℃孵育10 min。随后每孔加入试剂三120 μL 和试剂四90 μL，混匀后于37 ℃孵育30 min，加入蒸馏水90 μL。从上述反应液中吸取200 μL于酶标板测定630 nm 处吸光度。根据试剂盒提供公式计算尿素氮水平。实验重复3 次，取平均值。

1.3.5 Hotair 及PRC2 复合物（EZH2、SUZ12、EED）、LSD1 mRNA 表达水平检测 采用qRT-PCR 法。取肾皮质按照RNA 提取试剂盒说明书提取RNA，使用NanoDrop 测定RNA 的浓度与纯度。此后使用反转录试剂盒反转录成cDNA，利用qRT-PCR 试剂盒进行qRT-PCR 检测Hotair 及其他基因的表达，以GAPDH 为内参。 反应体系为：2×SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL，共20 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min，随后95 ℃5 s 变性，60 ℃30 s 扩增，共循环40 次。采用2-ΔΔCt法计算Hotair及其他基因mRNA 相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.6 PRC2 复合物、LSD1 及肾皮质纤维化相关蛋白COL1A1、COL4A1、α-SMA 和E-cadherin 表达水平检测 采用Western blot 法。取保存的肾皮质称量后加入裂解液，冰上超声破碎组织，13 000 r/min 离心5 min，取上清液行BCA 蛋白定量。以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳法分离目的蛋白，300 mA 恒流下转膜90 min至聚偏二氟乙烯膜，3%BSA 封闭1 h 后按说明书稀释倍数加入对应的SUZ12、LSD1、EZH2、EED、α-SMA、E-cadherin、COL1A1、COL4A1 和GAPDH 抗体，4 ℃过夜孵育。洗涤3 次后于相应的二抗中孵育1 h 后再次洗涤3 次，随后进行显影，得到对应条带，并使用Image J 软件评估各个泳道的灰度值。蛋白相对表达水平=各组灰度值/对照组平均灰度值。

1.4 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 22.0 统计软件。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干扰lncRNA Hotair 对CKD 小鼠体重与肾功能的影响 与对照组比较，CKD 组和CKD+sh-Ctrl 组小鼠的体重随年龄增长显著降低，血清肌酐和尿素氮水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与CKD+sh-Ctrl 组比较，CKD+sh-Hotair 组小鼠体重有明显升高（均P＜0.01），但仍低于对照组；血清肌酐和尿素氮水平均降低（均P＜0.01），但仍高于对照组，见图1。

图1 干扰lncRNA Hotair 对CKD 小鼠体重与肾功能的作用（A：4 组小鼠体重的变化；B：4 组小鼠肌酐水平比较；C：4 组小鼠尿素氮水平比较）

2.2 干扰lncRNA Hotair 对CKD 小鼠模型肾脏形态及组织学的影响 与对照组比较，CKD 组小鼠肾脏明显萎缩，而CKD+sh-Hotair 组小鼠的肾脏大小及形态有明显改善，见图2A（插页）。HE 染色和Masson 染色显示CKD 组小鼠肾组织部分小管扩张，肾间质炎症细胞浸润，肾间质纤维化，而CKD+sh-Hotair 组较CKD+sh-Ctrl 组明显改善，见图2B-C（插页）。

图2 干扰lncRNA Hotair 对CKD 小鼠模型肾脏形态及组织学的影响（A：4 组小鼠肾脏形态；B：4 组小鼠肾脏HE 染色；C：4 组小鼠肾脏Masson 染色）

2.3 4 组小鼠肾皮质lncRNA Hotair 表达水平比较与对照组比较，CKD 组小鼠肾皮质lncRNA Hotair 表达水平升高（P＜0.01）。与CKD+sh-Ctrl 组比较，CKD+sh-Hotair 组小鼠肾皮质lncRNA Hotair 表达水平降低（P＜0.01），敲低效果满意，见图3。

图3 4 组小鼠肾皮质lncRNA Hotair 表达水平比较

2.4 干扰lncRNA Hotair对肾皮质纤维化相关蛋白表达的影响 与对照组比较，CKD 组小鼠肾皮质COL1A1、COL4A1、α-SMA 蛋白表达水平均升高，而E-cadherin蛋白表达水平下降。与CKD+sh-Ctrl 组比较，CKD+sh-Hotair 组小鼠肾皮质COL1A1、COL4A1、α-SMA 蛋白表达水平均下降，E-cadherin 蛋白表达水平恢复，见图4。

图4 干扰lncRNA Hotair 对肾皮质纤维化相关蛋白表达的电泳图

2.5 干扰lncRNA Hotair 对PRC2 复合物和LSD1 的影响 与对照组比较，CKD 组小鼠肾皮质LSD1、EZH2、EED mRNA 和蛋白表达水平均升高，而SUZ12 mRNA和蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与CKD+sh-Ctrl 组比较，CKD+sh-Hotair 组小鼠肾皮质LSD1、EZH2、EED mRNA 和蛋白表达水平均降低，SUZ12 mRNA 和蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图5。

图5 干扰lncRNA Hotair 对PRC2 和LSD1 的影响（A：4 组小鼠肾皮质SUZ12 mRNA 表达水平比较；B：4 组小鼠肾皮质LSD1 mRNA表达水平比较；C：4 组小鼠肾皮质EZH2 mRNA 表达水平比较；D：4 组小鼠肾皮质EED mRNA 表达水平比较；E：4 组小鼠肾皮质SUZ12、LSD1、EZH2、EED 蛋白表达的电泳图）

3 讨论

lncRNA 是一类长度超过200 nt 的非编码RNA 分子，通过介导染色质重塑、转录后调控、蛋白的翻译和翻译后的蛋白修饰等发挥作用[9]。目前已发现多种lncRNA 参与调控糖尿病肾病[10-11]、间质性肾炎[12]、急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）[13]等疾病的肾脏纤维化过程。lncRNA Hotair 在多种癌症[14-15]和心脏[16]、肝脏纤维化[5]中表达上调，已被证明是一种潜在的治疗靶点，但是其在肾脏纤维化中的作用仍有待进一步探索。

本研究构建了腺嘌呤诱导的CKD 小鼠模型[17]，发现Hotair 表达上调，与Zhou 等[18]在UUO 小鼠模型中发现Hotair 表达上调相一致。通过尾静脉注射腺相关病毒敲低Hotair，肾纤维化病理及生化指标均显著改善，且可减少细胞外基质蛋白COL1A1、COL4A1 和α-SMA的表达，说明其在肾纤维化过程中发挥重要作用。

此前研究发现表观遗传修饰在肾脏纤维化中发挥重要作用[6]。PRC2 是一种重要的染色质修饰复合物，由包括EED、SUZ12、EZH2 的核心亚基及其他辅助因子组成[7]。PRC2 可以在组蛋白H3 的27 位赖氨酸上沉积一个或多个甲基（分别为H3K27me1、H3K27me2和H3K27me3），并通过适当的基因沉默来发挥功能[7]。一项研究发现Hotair 可招募PRC2 至靶基因，从而通过促进甲基化使基因沉默[14]。另一项研究发现Hotair 的5'端与PRC2 结合，而3'端与LSD1 结合，从而作为分子支架协调PRC2 和LSD1 靶向染色质，偶联组蛋白H327位赖氨酸甲基化和4 位赖氨酸去甲基化[8]。EZH2 在糖尿病肾病[19-20]、高尿酸诱导的CKD 肾脏纤维化[21]中发挥重要作用。EZH2 在UUO 小鼠模型和CKD 患者培养的肾成纤维细胞中高表达，可通过下调Smad7 和PTEN的表达激活促纤维化信号通路[22]。在AKI 向CKD 转变的过程中，抑制EZH2 可减轻EMT 并阻断M2 巨噬细胞极化来改善AKI 后肾脏纤维化[23]。本研究发现EZH2、EED、LSD1 在腺嘌呤诱导的CKD 小鼠肾组织中也高表达，与其他研究结果一致，并且敲低Hotair 能部分抑制其表达并缓解肾脏纤维化，说明Hotair 可能通过其分子支架作用调控表观遗传修饰在CKD 纤维化进程中发挥作用。

综上所述，lncRNA Hotair 在CKD 小鼠模型中表达升高，敲低Hotair 可缓解肾脏纤维化，可能与Hotair 作为PRC2 和LSD1 的分子支架介导的表观遗传修饰相关，本研究为肾脏纤维化的治疗提供了新的思路和潜在靶点。