低温下有氧运动干预对糖尿病肾病肾脏代谢和短期预后的影响

王琳琳,李志鹏,刘翠兰,韩小丽,郭宝珠,刘 华,刘圣君

糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性并发症之一,其特征为白蛋白尿排泄持续性增加,随病程进展,会发展为终末期肾病。据调查[1]显示,2017年中国成年人群糖尿病的患病率为12.8%,近年来其发病率持续增加,糖尿病肾病发病率也随之增加[2]。因此,加强糖尿病肾病的防治有着重要意义。既往已有多项研究[3-5]报道长期、规律的有氧运动干预可改善糖尿病肾病患者的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗,在一定程度上抑制肾脏损伤。低温下有氧运动干预可改善慢性肾脏病3期患者肾功能,降低肾脏预后不良事件发生率[6],但关于其机制鲜有报道。此外,对于糖尿病肾病,低温下有氧运动干预的效果及短期预后效应也鲜有研究报道。该研究在低温下进行有氧运动干预,探究其对糖尿病肾病小鼠和患者肾脏代谢的影响及短期预后效应,以期为低温下有氧运动治疗糖尿病肾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1动物 40只SPF级雄性DBA/2J小鼠,6～8周龄,体质量20～22 g,购自河北北方学院实验动物中心[许可证号SYXK(冀)2019-004],室温22～24 ℃,相对湿度40%～50%,适应性饲养1周。该研究获该学院实验动物福利伦理审查委员会批准(批准号:HBNU20200130022092)。

1.1.2病例资料 前瞻性入组河北北方学院附属第一医院2020年6—11月的194例糖尿病肾病患者。纳入标准:① 有糖尿病史,且满足以下任意一条:随机尿白蛋白/肌酐比值(urine albumin/creatinine ratio,UACR)≥30 mg/g或随机尿白蛋白排泄率≥30 mg/24 h,且此后3～6个月的3次检查中2次达到或超过临界值;估算的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)<60 ml/(min·1.73 m2)3个月以上;病理改变符合糖尿病肾病;② 糖尿病肾病G3A3期;③ 年龄>18岁。排除标准:① 既往有自身免疫性疾病或恶性肿瘤;② 肢体残疾影响运动;③ 中途退出研究;④ 伴其他原发或继发性肾小球疾病。该研究遵守《赫尔辛基宣言》,获该院医学伦理委员会批准,受试者均签署知情同意书。

1.1.3主要试剂与仪器 链脲佐菌素、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司,放射免疫沉淀裂解液、二辛可宁酸试剂及化学底物发光液均购自上海碧云天生物技术有限公司,核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,NRF2)、血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体及二抗均购自艾博抗(上海)贸易有限公司,7020型全自动生化分析仪购自北京日立有限公司,KW-PT型动物实验跑台机购自南京卡尔文生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1糖尿病肾病小鼠模型制备、成模标准、分组及干预方案 采用腹腔注射链脲佐菌素法(40 mg/kg,连续5次)构建糖尿病肾病模型[7]。糖尿病模型成模标准为随机血糖>16.7 mmol/L,糖尿病肾病模型成模标准为糖尿病模型成模4周后24 h尿蛋白>30 mg[7]。40只小鼠随机分为正常组、模型组、低温组、运动组和低温运动组,每组8只。除正常组外均造糖尿病肾病模型,此外,运动组和低温运动组分别在22～24 ℃和3～5 ℃环境下给予为期8周的跑台运动干预,每天1次,每次1 h,每周连续5 d,速度25 m/min。低温组仅在运动组和低温运动组运动时给予3～5 ℃环境干预。期间未给予药物干预。

1.2.2糖尿病肾病小鼠生化指标检测 于末次干预后,断尾法收集血液,用生化分析仪检测小鼠的空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和24 h尿蛋白水平。

1.2.3糖尿病肾病小鼠肾脏组织形态观察 断尾后,断头处死小鼠,分离出肾脏组织,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋后依次切片、脱蜡、水化和HE染色,光学显微镜下观察肾脏病变情况,主要包含肾组织轮廓清晰程度,肾小球和肾小管形态等。每张肾脏病理图像随机选取3个非重叠视野,参照文献[8]进行半定量评分,总分5分,评分越高表明肾脏损伤越严重。

1.2.4蛋白质免疫印迹法检测糖尿病肾病小鼠肾脏组织中NRF2和HO-1水平 取1.2.3中肾脏组织,用放射免疫沉淀裂解液提取肾脏组织中蛋白,用二辛可宁酸法定量;10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,电压120 V至溴酚蓝跑出胶面,电流300 mA转膜2 h,5%脱脂牛奶室温封闭1 h;一抗(NRF2和HO-1稀释比分别为1 ∶500和1 ∶2 000,GAPDH稀释比1 ∶5 000)4 ℃孵育过夜;二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h;化学底物发光液显影。

1.2.5受试者分组及干预方案 根据患者自身情况给予降糖、降压及纠正脂代谢紊乱等基础治疗,此外,在不改变原有生活习惯的情况下,遵循患者个人意愿,根据低温有氧运动干预频次将患者分为运动组(1次/周)、运动组(≥2次/周)和对照组(0次/周)。运动组于2020年12月—2021年3月行低温有氧运动干预,运动方式为滑冰,运动前进行15 min热身,然后运动1 h,受试者根据自身情况调整速度和强度,每周至少1次,干预4个月。

1.2.6受试者信息收集 收集年龄、性别、体质指数(body mass index,BMI)、吸烟史、糖尿病病程、糖化血红蛋白(glycated hemoglobin A1c,HbA1c)、冠心病史、高血压史、是否应用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)/血管紧张素受体阻滞剂(angiotensin II receptor blocker,ARB)、二甲双胍和钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor,SGLT2i)类药物、干预前后的Scr、BUN、尿酸(uric acid,UA)、UACR和eGFR等信息。

1.2.7受试者随访 于低温有氧运动干预结束后用电话和复诊方式随访1年,每1～3月随访1次,将Scr水平翻倍、进展为糖尿病肾病G4期或发生不良心脑血管事件(包含急性冠脉综合征、心力衰竭、靶血管血运重建及缺血性脑卒中等)定义为预后不良[9]。

2 结果

2.1 糖尿病肾病小鼠的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平与正常组比较,模型组的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,运动组和低温运动组的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05)。与低温组和运动组比较,低温运动组的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05)。见表1。

表1 糖尿病肾病小鼠的FBG、Scr和BUN水平

2.2 糖尿病肾病小鼠的肾脏病变情况正常组的组织轮廓清晰,肾小球、肾小管形态规则。与正常组比较,模型组的肾小球肥大,肾小管上皮细胞存在不同程度的坏死,细胞排列混乱。与模型组比较,运动组和低温运动组的组织形态均有不同程度改善。与低温组和运动组比较,低温运动组的肾小球肥大和肾小管扩张程度均减轻。见图1。正常组、模型组、低温组、运动组和低温运动组的肾脏损伤评分[0分、(4.13±0.84)分、(4.00±0.93)分、(2.75±0.46)分和(1.25±0.46)分]差异有统计学意义(F=28.988,P<0.001)。与正常组比较,模型组的肾脏损伤评分升高(P<0.05)。与模型组比较,运动组和低温运动组的肾脏损伤评分均降低(P<0.05)。与低温组和运动组比较,低温运动组的肾脏损伤评分降低(P<0.05)。

图1 糖尿病肾病小鼠的肾脏病变情况 HE×400

2.3 糖尿病肾病小鼠的NRF2和HO-1水平比较正常组、模型组、低温组、运动组和低温运动组的NRF2(1.00±0.03、0.35±0.01、0.32±0.05、1.42±0.05和1.84±0.07)和HO-1(1.00±0.03、0.56±0.01、0.49±0.05、1.15±0.04和1.40±0.04)水平差异均有统计学意义(WelchF=2 642.449、1 093.935,均P<0.001)。与正常组比较,模型组的NRF2和HO-1水平均降低(P<0.05)。与模型组比较,低温组的HO-1水平降低,运动组和低温运动组的NRF2和HO-1水平均升高(P<0.05)。与低温组或运动组比较,低温运动组的NRF2和HO-1水平均升高(P<0.05)。见图2。

图2 糖尿病肾病小鼠的NRF2和HO-1水平

2.4 糖尿病肾病患者的临床资料运动组(1次/周)、运动组(≥2次/周)和对照组的年龄、性别构成、BMI、吸烟史、糖尿病病程、HbA1c、冠心病占比、高血压占比、应用ACEI/ARB、二甲双胍和SGLT2i类药物占比差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 糖尿病肾病患者的临床资料

2.5 糖尿病肾病患者的肾功能指标低温有氧运动干预前,运动组(1次/周)、运动组(≥2次/周)和对照组的Scr、BUN、UA、UACR和eGFR水平差异均无统计学意义。低温有氧运动干预后,运动组(1次/周)和运动组(≥2次/周)的BUN和UACR水平均较干预前降低(P<0.05);对照组的Scr、BUN和UACR水平均较干预前升高(P<0.05),eGFR水平较干预前降低(P<0.05);运动组(1次/周)和运动组(≥2次/周)的Scr、BUN和UACR水平均低于对照组(P<0.05),eGFR水平均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 糖尿病肾病患者的肾功能指标

2.6 糖尿病肾病患者的短期预后运动组中短期预后不良5例,其中进展为糖尿病肾病G4期2例,并发急性心肌梗死3例;对照组中短期预后不良18例,其中进展为糖尿病肾病G4期8例,并发不稳定心绞痛3例,急性心肌梗死7例。运动组(≥2次/周)的累积预后不良发生率为2.13%(1/47),低于运动组[1次/周,11.43%(4/35)]和对照组[16.07%(18/112);Log-Rank χ2=6.043,P=0.049]。见图3。

图3 糖尿病肾病患者的预后不良发生情况

COX回归分析结果显示运动干预1次/周(HR=0.714,95%CI:0.242～2.109)较不干预并不能降低糖尿病肾病患者短期预后不良发生风险,运动干预≥2次/周(HR=0.123,95%CI:0.016～0.925)较不干预可降低糖尿病肾病患者短期预后不良发生风险。

3 讨论

糖尿病肾病具有发病率高、治疗费用高、预后差等特点,严重影响着患者的生活质量和生命安全。据报道[10],全球因糖尿病肾病进展为终末期肾病的患者占30%～50%。在中国,糖尿病肾病已成为中老年人终末期肾病发病的首要原因[11]。在糖尿病肾病发病早期给予及时、有效的干预,可延缓病情进展,甚至逆转[12]。目前,临床针对糖尿病肾病的治疗主要依靠药物、透析及肾移植手术等,忽视了运动干预的作用[13]。该研究主要探究低温下有氧运动干预对糖尿病肾病小鼠和患者肾脏代谢的影响及短期预后效应。

该研究采用腹腔注射链脲佐菌素法构建糖尿病肾病模型,在低温环境下给予有氧运动干预,结果显示模型组的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均升高,运动组和低温运动组的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均降低,此外,低温运动组的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均低于低温组和运动组。上述结果提示低温下有氧运动干预可以降低糖尿病肾病小鼠血糖,纠正肾脏代谢异常,其效果优于单纯低温环境干预和室温下有氧运动干预。此外,肾组织HE染色结果显示模型组的肾小球肥大,肾小管上皮细胞存在不同程度的坏死,细胞排列混乱,其肾脏损伤评分较正常组升高;运动组和低温运动组的组织形态均有不同程度改善,两组肾脏损伤评分均较模型组降低;低温运动组的肾脏损伤程度低于运动组,其肾脏损伤评分较运动组降低。该结果进一步说明了低温下有氧运动干预对糖尿病肾病小鼠的肾脏保护作用,其效果优于单纯有氧运动干预。

NRF2和HO-1是细胞内抗氧化反应的重要因子,据报道[14-15],激活NRF2/HO-1信号通路可有效降低因高糖环境所产生的活性氧,抑制氧化应激反应诱导的胰岛素抵抗,延缓糖尿病肾病进展。该研究结果显示模型组的NRF2和HO-1水平均降低,运动组和低温运动组的HO-1和NRF2水平均升高,但低温运动组的NRF2和HO-1水平更高。上述结果提示低温下有氧运动干预可上调肾脏组织中NRF2和HO-1表达,其上调效果优于单纯有氧运动干预。

为阐明低温下有氧运动干预对糖尿病肾病患者的作用,该研究用Scr、BUN、UA、UACR和eGFR作为评价肾功能的指标,结果显示低温下有氧运动干预后,运动组(1次/周)和运动组(≥2次/周)的Scr、BUN和UACR水平均低于对照组,eGFR水平均高于对照组,该结果提示低温有氧运动可降低糖尿病肾病患者Scr、BUN和UACR水平,提高eGFR水平,表明低温有氧运动可改善糖尿病肾病患者肾功能。此外,运动组(≥2次/周)的累积预后不良发生率低于运动组(1次/周)和对照组;COX回归分析结果显示运动干预1次/周较不干预并不能降低糖尿病肾病患者短期预后不良发生风险,运动干预≥2次/周较不干预可降低糖尿病肾病患者短期预后不良发生风险。上述结果提示低温下有氧运动干预可改善糖尿病肾病患者短期预后,其原因可能是低温下有氧运动可促进NRF2/HO-1信号通路表达,从而抑制糖尿病肾病患者体内炎症和氧化应激损伤,保护肾功能,改善预后。

综上所述,低温下有氧运动干预可纠正糖尿病肾病肾脏代谢异常,保护肾脏组织,降低短期预后不良发生风险,其机制可能与上调NRF2/HO-1轴表达有关。该研究尚存在一定不足,关于低温下有氧运动与常温下有氧运动对糖尿病肾病患者的肾功能及预后的保护作用未进行比较,下一步将针对上述不足进行补充,为低温下有氧运动的开展提供更多依据。