藏药三果汤治疗糖尿病作用机制的网络药理学与分子对接技术分析

郭爽,刘海鹏,申隽于,李蓉,夏宗霄,龙小妹,范源,

(1.云南中医药大学中药学院,云南 昆明 650500;2.云南中医药大学第二附属医院,云南 昆明 650216;3.南京中医药大学,江苏 南京 210023)

糖尿病(diabetic mellitus,DM)是一种以高血糖为特征的代谢性疾病,高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损,或两者兼有引起的。糖尿病临床常见类型为1型糖尿病和2型糖尿病,1型糖尿病是由于胰岛β细胞损伤导致胰岛素缺乏所致;2型糖尿病是胰岛素抵抗拌胰岛素缺乏所致[1]。长期高血糖会导致其他组织,包括眼、肾、心脏、血管的慢性损害、功能障碍等。流行病学显示,印度和中国的糖尿病患病率占全球糖尿病患病的40%。目前糖尿病的治疗主要以胰岛素注射[2]和二甲双胍等药物为主[3],但胰岛素在印度部分地区无法获得,在治疗过程中经济问题成为影响治疗的主要原因之一[4]。

在传统藏医学中,糖尿病被认为是“京尼萨库”病范畴,藏医理论认为“京尼萨库”主要是由于饮食起居不当等因素导致“三因”失衡引起,所谓“三因”指的是隆、赤巴、培根,即中医中的气、胆、痰。藏药三果汤,由诃子、毛诃子、余甘子三味药构成,其方名由印度“三果”经古丝路传播演变而成[5],具有清热、调和气血以及分离精浊等功效[6]。在大鼠体内实验研究表明,三果汤能降低空腹血糖水平[7],并能抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶活性[8]。体外细胞实验结果表明三果汤通过增强incretin/cAMP信号通路活性,影响胰岛β细胞增殖和凋亡[9]。在糖尿病并发症的治疗中,三果汤通过抑制TGF-β1和氧化应激,改善糖尿病肾病症状[10];改善TGF-β1、TNF-α、IL-1β,降低糖尿病神经病变进展。相关研究表明,癌症通路为三果汤主要通路之一,Ali Sahragard团队研究发现,三果汤提取物可抑制人肝癌细胞增殖,降低其存活率[11]。

网络药理学是基于系统生物学的理论,对生物系统的网络分析,选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的一门学科。强调对信号通路的多途径调节,是提高药物的治疗效果,降低毒副作用,提高新药临床试验成功率的有力手段。最早由我国学者李梢提出“网络靶标”,并制定首个标准《网络药理学评价方法指南》,为网络药理学这一新兴学科奠定了基础[12-13]。网络药理学能够通过对中药复方作用靶点及信号通路的分析,预测潜在的药理作用及信号通路,对中药复方的基础研究及临床应用提供了新思路[14]。本研究就藏药三果汤治疗糖尿病作用机制进行网络药理学分析及分子对接验证进行初步探讨,为后续实验提供思路。

1 实验方法

1.1 网络药理学

1.1.1 三果汤的活性成分及作用靶点采用TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php),分别检索三果汤中诃子、余甘子、毛诃子有效成分,并根据药物口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、类药性(Drug Likeness,DL)≥0.18进行初步筛选,由于TCMSP中检索毛诃子结果为无,则结合前期研究及文献,以及在PubChem数据库(http:pubchem.gov)检索结果整合毛诃子中化合物。使用UniPort数据库(http:www.uniprot.org uniprot )将化合物靶点蛋白名称转换为基因名,删去重复项,即得三果汤潜在作用靶点。

1.1.2 糖尿病相关靶点筛选以Diabetic为关键词在Genecard数据库(https://www.genecards.org)、DRUGBANK数据库(https://www.drugbank.ca/)进行检索,结合文献查阅结果,进行结果整合,删除重复项,使用UniPort数据库(http://www.uniprot.org uniprot )将靶点名转换为基因名。

1.1.3 构建药物靶点疾病靶点PPI网络及富集分析蛋白质相互作用网络(PPI)是指蛋白通过彼此之间的相互作用构成,来参与生物信息传递、基因表达调节、能量和物质代谢及细胞周期调控等生命过程的各个环节,系统地分析了蛋白在生物系统中的相互作用关系。

使用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)在线制作疾病靶点、药物靶点的VENN图,导出三果汤和糖尿病的共同靶点。使用STRING(https://string-db.org)数据库,将物种选为Homo Sapiens,设置靶点关联置信度为0.900,隐藏无蛋白相互作用靶点,获得PPI网络图。使用Cytoscape v3.9.1构建“药物-成分-靶点-疾病”关系网络。

采用Matescape数据库(https://metascape.org)进行GO富集分析和KEGG通路分析,物种选择“H specises”,选择“Custom Analysis”,分别进行KEGG通路分析和GO富集分析。 其中,GO富集分析包括细胞组分(CC)分析、分子功能(MF)分析和生物过程(BP)分析,通过富集分析可以看到目标基因在3个层面上的关联。筛选4次分析的数据前20个通路,绘制出富集条形图和气泡图。

1.2 分子对接使用PDB数据库(https://www.rcsb.org)下载蛋白靶点对应的晶体结构,在TCMSP中下载药物有效成分的3D结构的mol.2格式。使用AUTODock Tools去加氢,计算电荷等,为分子对接提供基础数据。使用AUTODock 进行分子对接,对接的结果通过Openbabel(Ver3.1.1)将其转换为pdb格式,用pymol2.6.0进行图像处理。

2 实验结果

2.1 三果汤中活性成分筛选通过TCMSP筛选及文献检索补充,可得三果汤中有效活性成分共48种,主要为萜类、黄酮类、多元酚类成分,活性靶点以没食子酸、诃子酸、诃子次酸、鞣花酸、槲皮素等为主(见表1)。

2.2 药物靶点、疾病靶点韦恩(VENN)分析根据TCMSP、Genecard、DRUGBANK数据库及文献筛选出三果汤有效成分对应靶点和糖尿病作用靶点,可知,三果汤成分有效靶点共283个,糖尿病疾病靶点共16 660个,经筛选得出具有作用靶点的有效化学成分35个。使用微生信网站绘制VEEN图(见图1),由图可知,三果汤与糖尿病作用靶点有269个共同靶点。根据VENN分析结果,由于有效成分名称复杂,故作图时,给予标号S1～S35命名,并使用Cytoscape 3.9.1绘制药物-成分-靶点-疾病网络关系图(见图2),节点度高的主要化学成分包括quercetin、ellagic acid、(-)-epigallocatechin-3-gallate等。

图1 三果汤药物作用靶点与糖尿病疾病靶点的VENN图

图2 药物-成分-靶点-疾病网络图(橘色为疾病与药物,蓝色为药物主要化学成分,绿色为药物与疾病作用靶点)

2.3 三果汤治疗糖尿病蛋白相互作用网络分析使用STRING数据库对三果汤治疗糖尿病蛋白之间相互作用的网络图构建,隐藏无蛋白相互作用靶点后,PPI网络中包含节点274个,节点之间包括1 238个蛋白作用关系以及464个预期作用关系。其中,AKT1、HAS2、MAP2K、CDH1、PRKCG、PLAT等靶点作用最为突出,预测可能作用靶点为:PSMA4、RFC2、PSMC4、TNFRSF1A、KEAP1。

A.GO-细胞组分分析;B.GO-生物过程分析;C.GO-分子功分析

2.4 三果汤治疗糖尿病GO功能富集使用Metascape数据库对进行GO功能富集(见图3),根据分析出的富集通路,选择富集的前20个绘制富集柱状图,由蓝色到红色-log10依次递减。GO功能富集分析从3个层面进行分析:细胞组分(CC)分析、分子功能(MF)分析和生物过程(BP)分析。从图中可知,从细胞组学层面分析,主要富集在膜筏、转录调节复合物、膜侧等;从分子功能层面分析,主要富集在蛋白质同二聚化活性、蛋白质结构域特异性结合、激酶结合等;从生物过程层面分析,主要富集在对激素的反应、对细胞因子的反应、对无机物的反应等。

2.5 三果汤治疗糖尿病KEGG通路富集分析使用Metascape数据库对进行KEGG通路富集分析(见图4),根据KEGG通路分析,三果汤治疗糖尿病的信号通路主要在癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、MAPK信号通路、化学致癌-受体激活以及在糖尿病并发症中的产生作用的AGE-RAGE信号通路。

图4 三果汤治疗糖尿病KEGG通路分析气泡图

2.6 分子对接结果根据三果汤有效成分筛选,选择鞣花酸(ellagic acid)、没食子酸(gallic acid)与KEGG通路分析通路靶点AKT1、HAS2、MAP2进行分子对接,结合能越小,有效成分和靶点结合的亲和力越大(见表2)。通过结合能可以看出,鞣花酸对靶点HAS2亲和力最好,同时没食子酸对HAS2的结合能存在一定的亲和力。对于靶点AKT1、HAS2、MAP2,鞣花酸的亲和力明显大于没食子酸。

表2 分子对接评分结果

3 讨论

通过TCMSP等数据库对藏药三果汤进行有效成分分析及筛选,并对糖尿病疾病靶点进行分析,三果汤与糖尿病的交集蛋白靶点有269个,其中AKT1、HAS2、MAP2、CDH1、PRKCG、PLAT等靶点作用最为突出,并预测PSMA4、RFC2、PSMC4、TNFRSF1A、KEAP1存在可能为作用的新靶点。对三果汤的研究中,作用成分最为突出的鞣花酸和没食子酸与作用靶点最为突出的AKT1、HAS2、MAP2进行分子对接,鞣花酸对HAS2的结合能为-5.45,存在较好的亲和力,且从对接图中也可看出构象较稳定,说明鞣花酸对糖尿病受体蛋白结合稳定,存在治疗作用。结合分析结果可推测,三果汤治疗糖尿病在AKT/MAPK通路存在可能作用机制。

流行病学数据显示,2017年我国老年人20%以上为糖尿病患者,2020年增长至30%以上[15]。随着糖尿病患病人群逐渐增加,针对其病症的治疗方式逐渐增多,如通过调节机体免疫及炎症因子的变化,改善糖尿病的胰岛素抵抗,从而降低糖尿病的发生发展[16]。在现代医学中,中药对糖尿病及糖尿病并发症存在良好的疗效,临床试验表明,中医药在辅佐糖尿病冠心病的治疗中,存在良好的辅助作用,并存在一定的安全性[17];白藜芦醇[18]、杨梅素[19]等化合物可诱导机体抗氧化应答,在糖尿病并发症心肌病病程发展过程中起到保护作用,且存在安全性[20];化瘀及通络中药在TGF-β1/p38MAPK信号转导通路中发挥到作用,可改善糖尿病肾病氧化应激,起到保护作用[21-22]。有关藏药的资料记载,三果汤在糖尿病的治疗中有良好的效果,具有降低空腹血糖,影响胰岛β细胞凋亡等[23]。藏药三果汤中主要成分之一余甘子中主要成分没食子酸可能升高葡萄糖转运酶载体(GLUT-2)和PPARγ的表达,发挥降血糖的药理作用[23]。诃子中有效成分诃黎勒酸能够降低大鼠进食后的血糖水平[24]。本文对藏药三果汤治疗糖尿病作用机制初步探讨,以为相关实验研究提供参考依据。

综上所述,三果汤具有多成分、多靶点的作用特点,对糖尿病有明显的治疗效果,本研究为后续三果汤治疗糖尿病的相关机制研究提供新思路。在本研究分析过程中发现,三果汤对癌症治疗存在可能性,为后续癌症治疗研究提供参考。本次实验结果基于数据库及文献进行分析,但由于三果汤治疗糖尿病作用机制复杂,具体机制需进一步相关实验验证。