中和抗体检测应用于新型冠状病毒mRNA疫苗效力分析

吴小红,赵丹华,所玥,彭沁华,王红玉,刘欣玉,李玉华

(中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室,国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室,北京 102629)

新型冠状病毒感染(coronavirus disease 2019,COVID-19)的流行对人类健康造成了严重影响。疫苗接种已被证实对严重疾病、降低住院率和死亡率非常有效[1-2]。其中mRNA疫苗由于具有能够同时诱导体液免疫和细胞免疫、研发和生产周期短、容易实现量产等优势,成为国际上主要采用的COVID-19疫苗研发技术。随着新型冠状病毒(2019-nCoV)变异株的不断出现,单价变异株疫苗及多价变异株疫苗可作为加强免疫以及异源序贯免疫来应对病毒变异造成的感染威胁[3]。新冠mRNA疫苗的效力评价目前尚无国际标准,欧洲及世界卫生组织(WHO)专家多推荐体外活性研究作为该疫苗效力评价的主要方法[4-6]。鉴于mRNA疫苗为创新技术疫苗,缺乏系统的疫苗质量研究经验,我国现阶段采用体内和体外双效力指标进行评价[7],体内效力的评价可利用动物免疫后检测中和抗体和/或总抗体的方法来进行[8]。本研究对新冠mRNA疫苗不同免疫剂量和不同免疫程序诱导的中和抗体反应进行初步研究,并对新冠变异株mRNA疫苗及二价mRNA疫苗免疫小鼠后的抗体阳性率和抗体水平进行体内效力分析,从而评价mRNA疫苗的质量。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级BALB/c小鼠,6～8周龄,体重 18～22 g,雌雄不限,由中国食品药品检定研究院动物所提供,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2022-0002,使用许可证号:SYXK(京)2022-0014,动物实验伦理批准文号:中检动(福)第2022(B)008号。

1.2 主要试剂及仪器10×PBS、TMB、终止液购自索莱宝公司;HRP标记的羊抗小鼠IgG购自美国Jackson公司;BSA购自美国Sigma公司;DMEM、胎牛血清、胰酶、HEPES、双抗均购自美国Gibco公司;荧光素酶检测试剂购自美国普洛麦格Promega公司;Promega GloMax 96 微孔板化学发光检测仪(Glomax navigator)购自美国普洛麦格Promega公司;酶标仪(Infinite M200)购自美国蒂肯公司。

1.3 实验用疫苗、细胞、不同型别假病毒实验用疫苗为国内企业生产的mRNA疫苗,编号V1～V9。其中V1为原型株疫苗,V2～V7为二价2019-nCoV变异株mRNA疫苗(Omicron BA.4/5株和Delta株双价、Omicron BA.4/5株和Beta株双价、Omicron BA.2株和原型株双价以及Omicron XBB.1.5株和BQ.1.7株双价),V8～V9是2019-nCoV变异株mRNA疫苗(Omicron BA.1);Vero细胞购自ATCC,本室传代保存;假病毒原型株、Delta株、Beta株、Omicron BA.1、Omicron BA.2、Omicron BA.4/5、Omicron XBB.1.5购自北京云菱生物技术公司;不同株2019-nCoV S蛋白抗原分别购自北京义翘神州生物技术有限公司和北京百普赛斯公司。

1.4 免疫剂量及免疫程序

1.4.1 mRNA疫苗免疫剂量和免疫程序研究将V1mRNA疫苗(原型株)配制成不同浓度后,按照不同的免疫程序分成A、B、C 3组:A组程序为免疫1针,14 d采血;B组程序为间隔7 d加强免疫1针后7 d采血;C组程序为间隔14 d加强免疫1针后7 d采血。每种免疫程序按照不同的免疫剂量分成3个小组,分别是每只小鼠注射2、5和10 μg,共计9组,每组10只小鼠。同时10只小鼠注射生理盐水作为阴性对照组。每只小鼠后肢肌肉注射100 μL疫苗,眼球取血分离血清,-20 ℃保存备用。用假病毒中和试验法检测抗2019-nCoV中和抗体。

1.4.2 实验疫苗免疫和检测mRNA变异株疫苗及二价疫苗均按照企业的免疫剂量和免疫程序进行免疫和采血,分离血清后于-20 ℃保存。分别进行中和抗体和IgG结合抗体的检测。

1.5 假病毒中和试验(PBNA法)按照操作规程进行[9-10],在96孔板上3倍系列稀释的血清100 μL,分别加入各型假病毒[用DMEM培养基稀释至1.3×104半数组织培养感染剂量(TCID50)/mL],每孔加入50 μL,同时设立病毒对照和细胞对照。37 ℃ 5% CO2培养箱中和1 h,加入2×105个/mL的Vero细胞悬液,每孔100 μL,37℃ 5% CO2培养箱培养20～28 h后,从细胞培养箱中取出96孔板,用多道移液器从每个上样孔中吸弃150 μL上清,然后加入100 μL荧光素酶检测试剂,室温避光反应2 min。反应结束后,用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸6～8次,使细胞充分裂解,从每孔中吸出100 μL液体,加于对应96孔化学发光检测板中,置于化学发光检测仪中读取发光值。计算抑制率={1-[样品组的发光强度均值-空白对照CC(Cell Control,CC)均值]/[阴性组的发光强度VC(Virus Control,VC)均值-空白对照值CC均值]}×100%。根据中和抑制率结果,按照Reed Muench法计算中和抗体滴度半数效应剂量(50% maximal effective concentration,EC50),EC50>30为抗体阳性。

1.6 特异性抗2019-nCoV Spike蛋白IgG抗体检测将2019-nCoV各株抗原分别用1×PBS稀释至2 μg·mL-1,取96孔板每孔加100 μL,(5±3)℃条件下包被过夜16 h,PBST洗板3次,拍干后加入封闭液(2%BSA溶液),100 μL/孔,37 ℃孵箱里封闭2 h,加入系列稀释后的待检测血清样本,37 ℃孵箱里孵育后1 h,PBST洗板3次,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体,每孔100 μL,37 ℃孵育后1 h,PBST洗板3次,加入底物TMB 50 μL,室温避光显色3～5 min,加入1 mol·L-1硫酸溶液终止液终止,150 μL/孔,在酶标仪上检测波长450 nm/630 nm 的OD值,以阴性小鼠吸光度均值的2.1倍为cut off值。血清A值大于cut off值为抗体阳性,取阳性A值最大的血清稀释度为血清的IgG抗体滴度。

1.7 统计学方法使用GraphPad Prism 8.0进行数据分析,相同免疫剂量不同免疫程序以及相同免疫程序不同免疫剂量间中和抗体滴度以及不同企业mRNA疫苗免疫后中和抗体之间比较采用单因素方差分析评估组间差异,中和抗体和IgG抗体之间差异采用t检验分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同免疫剂量和不同免疫程序的抗体反应针对原型株mRNA疫苗不同免疫剂量和免疫程序的中和抗体检测结果显示,2、5、10 μg mRNA疫苗免疫小鼠后,1针免疫组和2针免疫组抗体阳性率均为100%。2、5、10 μg首针免疫后14 d或21 d中和抗体反应具有明显的剂量-效应关系。相同免疫剂量、不同免疫程序结果显示,2针免疫组高于1针免疫组,其中2 μg剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(F=20.64,P<0.001);5 μg剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(F=18.27,P<0.001);10 μg剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义 (F=11.37,P<0.001)。2针免疫组中14 d加强免疫组高于7 d加强免疫组及1针组(F=57.13,P<0.001)。其中2 μg间隔7 d加强免疫和间隔14 d加强免疫组产生的中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为218和468,14 d为7 d的2.15倍,差异有统计学意义(t=3.40,P=0.003);5 μg间隔7 d加强免疫和间隔14 d加强免疫产生的中和抗体GMT分别为499和1 436,14 d为7 d的2.88倍,差异有统计学意义(t=3.62,P=0.002);10 μg间隔7 d加强免疫和间隔14 d加强免疫产生的中和抗体GMT分别为608和1 909,14 d为7 d的3.14倍,差异有统计学意义(t=3.23,P=0.005)。相同免疫程序、不同免疫剂量诱导的抗体反应结果显示,1针免疫组不同剂量间相比(F=7.33,P=0.003);2针免疫组,间隔7 d不同剂量间相比(F=6.40,P=0.005);2针免疫组,间隔14 d不同剂量间相比(F=7.64,P=0.002),差异均有统计学意义,结果见表1。

表1 V1疫苗不同免疫剂量和免疫程序的中和抗体滴度及阳性率

2.2 8家企业生产的新冠变异株mRNA疫苗体内效力检测结果8家企业生产的疫苗V2～V9按照企业的免疫剂量和免疫程序免疫BALB/c小鼠后,中和抗体及特异性IgG抗体检测结果见表2。

表2 不同企业生产的mRNA疫苗抗体检测结果

2.3 特异性IgG结合抗体和中和抗体结果分析检测结果以对数转换后进行t检验 ,组份1 IgG和EC50比较t=11.47,P<0.001 ;组份2 IgG和EC50比较t=17.56,P<0.001,均显示中和抗体检测结果和IgG结合抗体检测差异有统计学意义。Pearson相关系数r分别为0.42和0.22。虽然两种方法抗体检测结果相关性较差,但均可以检测到高水平的抗体特异性反应。两种方法检测各企业3～4批疫苗,IgG抗体结果批间变异系数在1.0%～7.6%,中和抗体结果批间变异系数在2.0%～7.9%,提示两种抗体检测方法均可以用于评价疫苗体内效价的批间一致性。各企业mRNA疫苗的中和抗体结果对数转换后进行组间方差分析,差异有统计学意义(F=70.03,P<0.001)。

3 讨论

新冠mRNA疫苗临床前和临床研究中均证实疫苗的有效性与动物或人群保护力之间有一定的量效关系[11-14]。中和抗体是最重要的保护性抗体,与2019-nCoV感染者症状严重程度之间也有一定的相关性[15-16]。因此建立标准的中和抗体检测平台技术对COVID-19疫苗进行评价尤为重要[17]。本研究采用的假病毒中和方法经国内多家实验室联合验证[9,18],抗体检测结果相对客观,与IgG结合抗体检测相比更能体现疫苗的免疫原性。尤其对于多价疫苗,假病毒中和抗体检测方法可实现对不同变异株抗体分别进行检测,能较好的反映出针对多价疫苗各毒株组份疫苗诱导的抗体中和活性。

通过对1批mRNA原型株疫苗不同免疫剂量和不同免疫程序的分析,提示mRNA疫苗免疫小鼠后的中和抗体水平与免疫剂量和免疫程序有密切关系。本研究发现,同等剂量下(2、5、10 μg)间隔7 d与间隔14 d 2针免疫的抗体结果差异有统计学意义,对于mRNA疫苗来说,间隔7 d的第2针加强免疫不是产生高滴度中和抗体的最适宜的程序,疫苗实际使用过程中第2针加强免疫的时间选择在21 d或28 d[11-12]。因此mRNA疫苗体内效力的评价应适当关注免疫程序的设计。研究结果显示mRNA变异株单价疫苗或二价疫苗中针对不同组分的IgG抗体滴度均在104.5～107.5间,符合各企业的质量标准(不低于103或104),且各企业生产的疫苗IgG抗体结果批间一致性良好,变异系数在1.0%～7.6%之间。假病毒法检测中和抗体滴度在102.6～104.8之间,不同企业生产的疫苗免疫后中和抗体水平差异有统计学意义(F=70.03,P<0.001),与国产mRNA疫苗已公布的Ⅰ～Ⅱ期临床研究数据一致,不同企业新冠mRNA疫苗在人体内产生的中和抗体滴度有差异[12-15 ]。各企业不同批次中和抗体检测结果变异系数为2.0%～7.9%。因此中和抗体检测可用于不同企业mRNA疫苗效力的比较研究以及疫苗批间一致性的评价。

辉瑞公司生产的BNT162b为30 μg/剂,莫德纳公司mRNA-1273为100 μg/剂。两款疫苗对2019-nCoV感染的保护效力分别达到了94.6%和94.1%,不同的人用剂量和免疫程序可产生相同的临床保护力[19-21]。mRNA-1273 Ⅲ期临床研究结果显示接种该疫苗后假病毒法检测中和抗体滴度半数抑制稀释(50% inhibitory dilution,ID50)为10、100和1 000,测算疫苗保护效力分别为78%、91%和96%[22];新冠灭活疫苗NVX-CoV2373中和抗体滴度ID50为50、100和7 230 (IU50·mL-1),疫苗保护效力分别为75.7%、81.7%和96.8%[23]。本研究结果显示国产新冠mRNA疫苗小鼠免疫后中和抗体均达到较高水平,无论是1针免疫还是2针免疫EC50除个别企业因单价组分配比含量低,造成滴度偏低(V4)外,其余企业中和抗体滴度均在在1 000以上甚至更高,提示国产新冠mRNA疫苗的体内效力结果已达到较高的标准要求。虽然本研究未利用上述新冠mRNA疫苗进一步开展攻毒保护力研究,但随着mRNA疫苗大量的临床研究数据以及真实世界的保护力数据公布,会对疫苗的效力评价标准提供更有效的数据支持。尽快建立效力评价用疫苗参考品和血清检测用标准物质,提高国产mRNA疫苗的质量评价水平是下一步研究方向。