‘无子瓯柑’E3 泛素连接酶基因CsRNF217 对转基因烟草育性的影响

叶潇铃，赵宇虹，姜 楠，张 敏，张 迟

（1.浙江农林大学 园艺科学学院 农业农村部亚热带果品蔬菜质量安全控制重点实验室，浙江 杭州 311300；2.浙江农林大学 园艺科学学院 浙江省山区农业高效绿色生产协同创新中心，浙江 杭州 311300；3.浙江农林大学 林业与生物技术学院 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300）

瓯柑Citrussuavissima优良新品种‘无子瓯柑’C.suavissima‘Seedless’是通过芽变选种获得的，其果实无核，遗传性状稳定[1]。与瓯柑相比，两者的花粉量相当，但‘无子瓯柑’花药不易开裂，自然散发的花粉少[2]。形态学和细胞学研究表明：小孢子母细胞减数分裂异常是‘无子瓯柑’雄性不育的重要原因之一[2-3]。瓯柑及‘无子瓯柑’花粉发育早期的花药转录组与蛋白质组关联分析结果表明：差异代谢通路主要富集在苯丙素生物合成、黄酮类化合物生物合成和苯丙氨酸代谢通路[4]。CsRNF217 基因是瓯柑与‘无子瓯柑’在小孢子母细胞时期与苯丙素生物合成途径密切关联的重要基因，与瓯柑相比，该基因在同时期的‘无子瓯柑’中显著上调表达；CsRNF217 基因的氨基酸序列中存在RINGHC_RBR 和IBR 2 个结构域，属于典型的单亚基RING-HC E3 亚家族，定位于细胞核[5]。

泛素化是真核生物中一种高度通用的翻译后修饰，它介导蛋白酶体降解、细胞运输、蛋白质相互作用和细胞蛋白质的功能激活[6-8]。泛素化级联需要3 种不同的酶催化：E1 泛素激活酶、E2 泛素结合酶和E3 泛素连接酶[9]。其中，E3 泛素连接酶具有显著的多样性，它决定了底物的特异性，并作为调节细胞反应的枢纽[10-11]。E3 泛素连接酶分为单亚基和多亚基两类。单亚基组由3 个主要的亚家族组成：RING、HECT 以及U-box 结构域家族[11-13]。CsRNF217 基因即属于单亚基RING 结构域家族。E3 泛素连接酶在植物的生长发育过程中起着关键的作用，包括细胞程序性死亡和抗病防御反应[14]、成花调控[15]、生物[16]和非生物应激反应[14]以及花粉发育[17-19]等。其中，在水稻Oryzasativa[17]、拟南芥Arabidopsis thaliana[18]、白菜Brassicacampestrisssp.chinensis[19]中发现的RING 型E3 泛素连接酶基因DSNP1、DAF、Bra015092 等在花粉发育过程中起重要作用。

本研究以过表达‘无子瓯柑’CsRNF217 的转基因烟草Nicotianatabacum植株为材料，通过对基因表达分析、转基因自交1 代植株(T1)花粉活力、转基因植株自交及与野生型烟草正反交的结实率等参数的测定，分析过表达CsRNF217 对转基因烟草植株育性的影响，为进一步揭示CsRNF217 基因在‘无子瓯柑’雌雄败育过程中的重要作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以野生型烟草(WT)作为对照，采用农杆菌Agrobacteriumtumefaciens介导法获得过表达CaMV35S::CsRNF217 的阳性转基因烟草[5](T0)。将T0自交种子穴盘播种获得转基因烟草自交1 代植株(T1)。采集T1阳性烟草植株6#、35#、63#株系的叶片及含苞待放花蕾的花药，立即置于液氮中速冻并于-80 ℃保存，用于半定量RT-PCR 分析。

1.2 DNA 提取及阳性植株鉴定

采集野生型烟草及T1烟草植株的叶片，采用CTAB 法提取DNA，以pCAMBIA 2300s :CsRNF217 质粒作为阳性对照，ddH2O 为阴性对照，用35S_F 及基因特异引物CsRNF217_R838_S[5](表1)进行PCR 检测筛选阳性植株，PCR 程序为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35 次循环；72 ℃，10 min；12 ℃保存。

表1 引物信息Table 1 Specific primers used in this study

1.3 花粉活力检测及半定量RT-PCR 分析

于晴天10:00 采集烟草含苞待放的花蕾，采用亚历山大染色法[20]对野生型烟草及经PCR 鉴定的T1阳性植株进行花粉染色活力检测，采用花粉离体培养法[21]对花粉染色活力显著下降的烟草单株进行花粉萌发试验，每个植株随机挑选3 朵花作为生物学重复。花粉粒被染为紫红色的视为有活力的花粉粒，花粉管长度大于或等于花粉粒直径视为萌发。花粉染色活力=着色花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100%，花粉萌发率=萌发花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100%。

使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa，日本)试剂盒，提取野生型烟草及花粉活力显著下降的T1烟草阳性植株花药RNA，采用EASYScript one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix (TransGen Biotech code#AE311- 03)试剂盒进行cDNA 合成，使用CsRNF217 基因对引物和烟草内参基因EF1α特异引物(表1)进行半定量RT-PCR 分析，程序为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，29 次循环；72 ℃，10 min；12 ℃保存。

1.4 野生型烟草及转基因T1 烟草植株杂交授粉

于晴天10:00 收集野生型和T1已开花，但未散粉植株的花药于离心管，4 ℃干燥保存备用。于傍晚用干净的小镊子摘去即将开放花蕾的花瓣和雄蕊。次日10:00 蘸取花粉轻点已分泌黏液的柱头，套袋，每个植株进行3 朵花的正反交重复，3 d 后摘去袋子。正反交组合配置中，正交授粉以转基因株系为父本，野生型为母本；反交授粉以野生型为父本，转基因株系为母本。种子成熟时统计每个单株采收的蒴果数，测量蒴果横径、纵径及种子总质量。

1.5 数据处理与统计分析

采用SPSS 软件对种子萌发率、花粉染色活力、花粉离体萌发率、蒴果横纵径及种子数量等进行了单因素方差分析(one-way ANOVA，LSD)。

2 结果与分析

2.1 T1 烟草植株阳性检测

T0烟草种子穴盘播种共获得137 个单株，其中6#株系16 株，35#株系80 株，63#株系41 株。以野生型及T0种子播种获得的烟草叶片DNA 为模板，经PCR 检测，共获得68 株阳性植株(表2)。其中，6#株系10 株，35#株系33 株，63#株系25 株，阳性率分别为62.5%、41.2%、61.5%。

表2 野生型及T1 烟草植株阳性率与花粉染色活力Table 2 Positive rate and pollen viability of wild type and T1 tobacco plants

2.2 花粉活力及半定量RT-PCR 检测结果

T1阳性烟草植株花粉的散粉量与野生型存在差异(图1)。野生型植株花药开裂后，散粉量多，可见大量花粉散布于花瓣及柱头；T1阳性烟草植株花药裂开后，散粉量少，几乎无可见花粉散出。经染色法和花粉离体萌发培养(图2)：T1阳性烟草植株花粉染色活力显著低于野生型植株(图3，P＜0.05)。有活力的花粉粒经亚历山大染色后呈紫红色，无活力的花粉粒呈黄褐色。野生型植株经亚历山大染色后花粉粒大多呈紫红色(94.5%)，阳性植株呈紫红色的花粉粒数量显著少于野生型(图3，P＜0.05)。其中6#株系的14 号单株(6#14)、35#株系的4 号单株(35#4)、63#株系的4 号单株(63#4)的花粉经亚历山大染色后着色率最低，分别为9.6%、12.0%、9.7%。有活力的花粉粒能在适宜的离体条件下萌发，T1阳性植株花粉粒的萌发率显著低于野生型植株(60.3%)。其中6#株系的9 号单株(6#9)、6#株系的14 号单株(6#14)、63#株系的4 号单株(63#4)的花粉粒萌发率在各株系中最低，分别为30.6%、29.0%、33.4%。半定量RT-PCR 分析显示(图4)：CsRNF217 基因在过表达的各株系中均能表达，其中，外源基因在63#株系各单株花药中的表达量最高。

图1 野生型与T1 阳性植株成熟花药形态及散粉情况Figure 1 Anther morphology and pollen release of wild type and T1 positive plants

图2 野生型及T1 阳性植株的花粉活力Figure 2 Pollen viability of wild type and T1 positive plants

图4 野生型及T1 阳性植株半定量RT-PCR 分析Figure 4 Semi-quantitative RT-PCR of wild type and T1 positive plants

2.3 野生型烟草及转基因T1 植株杂交授粉结果

对花粉染色活力、萌发率都显著低于野生型的T1转基因阳性单株进行授粉(表3，图5)表明：自交和与野生型进行正反交的各授粉组合均能结实，但蒴果大小及种子数量存在较大差异。蒴果横径的比较结果显示：转基因63#株系自交、与野生型进行正反交的蒴果横径均显著小于野生型自交的蒴果(P＜0.05)；35#株系自交蒴果的横径显著小于野生型自交(P＜0.05)。蒴果纵径的比较结果显示：转基因63#株系自交和与野生型反交的蒴果纵径均显著小于野生型自交(P＜0.05)，其余组合与野生型自交无显著差异。根据烟草原始种的种子千粒重(0.087 g)[22]，计算每个株系的单果种子数量。阳性株系自交、与野生型正反交获得的种子数量都显著低于野生型自交种子数(P＜0.05)，但转基因株系之间无显著差异。

图5 野生型与T1 阳性植株自交及与野生型正反交授粉后的蒴果及种子Figure 5 Capsules and seeds of wild type and T1 positive plants after self-crossing and cross-pollination with wild type

表3 野生型及阳性株系自交及杂交试验的蒴果大小和种子数量Table 3 Capsule and seed number in selfing and hybridization test

3 讨论

本研究表明：过表达CsRNF217 的烟草植株在花粉染色活力、花粉萌发率、蒴果大小及种子数量上均显著低于野生型，说明过表达CsRNF217 降低了转基因烟草的小孢子育性，甚至对胚囊育性也存在一定的影响。

近年来的研究表明：RING 型E3 泛素连接酶基因参与了植物花粉发育[19]、花药开裂[18]、胚囊发育[17]等生命过程。水稻中的RING 型E3 泛素连接酶DSNP1 与水稻减数分裂过程中的联会复合体组装和同源重组关系密切，其突变体dsnp1 中形成的稳定同源配对和重组交叉严重减少，并最终形成活性较低的花粉[17]。然而，白菜中过表达E3 泛素连接酶基因Bra015092，也降低了转基因白菜的花粉染色活力和萌发率，并导致了花粉外部形态的畸形[19]。前期研究表明：‘无子瓯柑’成熟花粉的染色活力和离体萌发率均显著低于有籽瓯柑，其小孢子母细胞减数分裂异常[2-3]，CsRNF217 的表达在小孢子发育早期显著上调[5]。本研究中过表达CsRNF217 的烟草花粉离体萌发率为野生型的一半，花粉染色活力则更低。推测CsRNF217 基因可能通过负调控小孢子母细胞的减数分裂过程参与‘无子瓯柑’的花粉发育。拟南芥E3 泛素连接酶基因DAF在雄蕊中特异表达，并通过正向调控茉莉酸生物合成途径来促进花药开裂，通过干涉实验抑制其表达的植株则表现为雄性不育[18]。‘无子瓯柑’的花药自然开裂难、散粉量低[2-3]，实时定量PCR 结果显示：CsRNF217 基因在雄蕊的表达丰度显著高于其他花器官[5]。本研究中，过表达CsRNF217 的转基因烟草也表现出自然散粉较弱的特性，推测CsRNF217 可能参与了花药开裂的调控。

以野生型花粉对水稻不育突变体dsnp1 进行授粉，突变体不能结实，表明该突变体既是雄性不育的，也表现出雌性不育[17]，说明该RING 型E3 泛素连接酶DSNP1 对水稻的雌雄育性都有影响。本研究表明：转基因烟草不仅花粉活力显著下降，其种子数量也显著减少，说明CsRNF217 的超量表达在负调控花粉育性的同时，对胚囊的育性也存在一定的调控作用。在生产实践中，‘无子瓯柑’在同其他有籽柑橘品种混栽时也表现无籽，说明胚囊败育是‘无子瓯柑’果实无核的重要原因，因此CsRNF217 对‘无子瓯柑’胚囊育性的影响值得进一步研究。

4 结论

E3 泛素连接酶基因CsRNF217 对转基因烟草的育性存在显著影响，过表达‘无子瓯柑’CsRNF217 的T1烟草阳性植株雌雄育性均显著下降，推测CsRNF217 对‘无子瓯柑’的育性存在负调控作用。