脑脊液宏基因组二代测序对临床高度疑似颅内感染病原学诊断的价值

张业鹏,毛宇径,谢佳丰,徐东,姜毓敏,张娈娈

(郑州大学第一附属医院 急诊重症监护室,河南 郑州 450000)

颅内感染是由各种病原体侵犯脑实质、脑膜等引起的严重中枢神经系统感染性疾病[1],目前常见病原体包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等,可见于成人及儿童,具有高发病率及死亡率,尤其对于颅脑术后患者,继发颅内感染可增加患者住院时间及住院花费,对患者预后有不利影响[2]。颅内感染患者的临床表现常为非特异性,可表现为头痛、发热、恶心、呕吐、抽搐等,重症者可出现意识障碍、呼吸衰竭或循环衰竭等等[3]。对于颅内感染患者,由于脑脊液载菌量较少,因此传统脑脊液细菌培养检测周期长、阳性率较低且对于病毒、真菌及厌氧菌感染常不能得出有利于临床治疗的结果。对颅内感染患者病原学进行早期诊断可为临床抗感染药物的针对性选择和改善患者预后提供帮助。因此,宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)技术应运而生,且mNGS以其“高通量优势”可明显提高颅内感染患者病原体检出率及缩短其诊断时间,为更好地指导临床抗生素应用提供了可能[4],且理论上根据其检测特性,对所有具有基因组的病原体均有被检出可能。因此,在临床上颇为推广,但其对于脑脊液的各类病原体的检测特异度及灵敏度仍需进一步研究及探讨[5]。本研究通过对30例脑脊液病原体宏基因测序的研究,探讨mNGS在高度疑似颅内感染患者诊断中的潜在应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究符合伦理学要求,并通过郑州大学第一附属医院伦理委员会批准(伦理号2022-KY-1059-002)。回顾性分析2021年9月1日至2022年10月31日就诊于郑州大学第一附属医院急诊重症监护室的30例高度疑似颅内感染患者的病例资料,其中重度颅脑损伤后行“颅内血肿清除术、去骨瓣减压术”后患者19例,蛛网膜下腔出血行“颅内动脉瘤栓塞术、腰大池引流术”后患者5例,考虑原发性颅内感染无手术患者6例。其中送取脑脊液男24例,女6例。详细记录30例患者的性别、年龄,在留取患者脑脊液标本前及标本后24 h内,分别获取外周血常规、血糖、脑脊液检验及其他辅助检查结果。颅内感染诊断按照《神经外科中枢神经系统感染诊治中国专家共识(2021版)》中颅内感染的诊断标准[6],诊断依据如以下标准。(1)核心体温≥38 ℃或<36 ℃,意识及精神状态下降;伴有头痛、恶心呕吐、视盘水肿等颅内高压症状;颈项僵硬,神经状态受损,有脓性脑脊液流出的证据。(2)脑脊液浑浊、黄色或呈脓性,脑脊液白细胞计数>100×106L-1、中性粒细胞百分比>70%、蛋白质增加(>45 mg·dL-1)和葡萄糖水平降低(<2.2 mmol·L-1)或脑脊液葡萄糖/血糖比值<0.4。(3)在无症状的情况下,具有正常葡萄糖、蛋白质和细胞计数水平的阳性脑脊液培养物或革兰氏染色被视为污染。纳入标准:年龄>14岁;临床高度怀疑颅内感染;通过腰椎穿刺术留取脑脊液行mNGS检测及常规微生物培养。排除标准:腰椎穿刺或腰大池引流无脑脊液流出;患者家属拒绝行脑脊液mNGS或常规微生物培养任何一项。

1.2 研究方法

1.2.1脑脊液标本留取

严格无菌下操作、取脑脊液(腰椎穿刺术留取)10 mL左右,其中取5 mL送脑脊液常规、生化检查,余5 mL分别送检细菌培养及mNGS,送检脑脊液至微生物结果出来时间为检测时间。

1.2.2传统微生物培养

通过腰椎穿刺术或患者脑脊液,分别接种于血琼脂平板、巧克力平板行细菌培养,接种于念珠菌显色平板、沙式葡萄糖琼脂培养基平板行真菌培养,分枝杆菌培养系统进行分枝杆菌培养。

1.2.3脑脊液mNGS

选取留取的脑脊液3～5 mL,依次对其进行片段化处理、核酸提取、提取物质控、文库制备、上机检测,以及人源序列去除等,最终得出有效数据。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般资料

高度疑似颅内感染患者共30例,共送脑脊液标本30例,男24例,女6例,年龄37～84岁,颅内感染患者17例,无颅内感染患者13例,颅内感染与无颅内感染两组年龄、外周血白细胞、中性粒细胞百分比、降钙素原差异无统计学意义(P>0.05),脑脊液中有核细胞数、糖、氯化物、总蛋白差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 颅内感染与无颅内感染患者一般资料比较

2.2 mNGS与常规培养对颅内感染诊断的特异度、敏感度比较

共30例样本,mNGS阳性结果13例,与颅内感染诊断相符合10例,3例与颅内感染诊断不符,阴性结果17例,阴性结果中与颅内感染诊断不相符10例,与临床诊断相符合7例,mNGS对总体颅内感染的特异度为76.92%,灵敏度为58.52%;常规微生物培养有3例阳性结果,培养结果均为细菌,且均与颅内感染诊断相符合,阴性结果27例,与颅内感染诊断不相符14例,与颅内感染诊断相符合13例,对颅内感染的特异度为100.00%,灵敏度为17.65%。见表2。脑脊液mNGS总体检测阳性率(43.33%)高于常规培养法(10.00%),差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 mNGS对颅内感染的诊断价值

2.3 检测时间

mNGS检测时间为36.3(26.85,38.40)h,低于常规培养的104.2(91.75,118.70)h,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 检测微生物种类

在mNGS阳性结果中:细菌检出分别为肺炎克雷伯菌3例,鲍曼不动杆菌1例,粪肠球菌3例,铜绿假单胞菌2例,嗜麦芽窄食单胞菌3例,单核细胞增生李斯特菌1例,沙雷氏菌1例,加德纳菌1例;病毒检出分别为单纯疱疹病毒4例,人类疱疹病毒2例,巨细胞病毒2例,淋巴隐病毒1例,人类细小病毒1例,细环病毒1例;另检出曲霉菌2例,毛滴虫1例。常规培养检出粪肠球菌1例,鲍曼不动杆菌1例,铜绿假单胞杆菌1例,均符合颅内感染临床诊断及与mNGS结果相符合。

3 讨论

颅内感染可发生于各种免疫力低下及颅脑术后患者,颅内感染的发生明显增加了患者住院时间及其住院花费[7],对于发生或者高度疑似颅内感染患者,由于颅内血脑屏障保护作用,细菌、真菌及病毒在脑脊液的数量较血液中明显降低[8-10],限制了其培养的阳性率,因此对于颅内感染中病原体的鉴别一直为临床难解之题[11],尤其对于无症状感染者诊断难度更高[12],而临床广泛应用的常规细菌培养其培养周期长且能培养菌种有限,常不能从病原体上确诊,直接影响颅内感染治疗中抗生素的早期选择及患者早期病情转归。mNGS是一种基因层面的非培养性技术,能够快速全面地检测病原体。大量研究表明,mNGS具有更高的病原体鉴定特异性,且其受抗生素应用影响较小,但在应用时易被干扰[13-14]。

本研究结果显示mNGS检测总体阳性率高于常规细菌培养,且其研究周期较常规培养短,对病原体筛检速度领先于常规细菌培养,为临床医生的更加精准化治疗提供了一个更为快速、高效的诊断思路。这与Lin等[15]研究发现mNGS可以帮助临床医生制定更合理的用药方案、降低患者的用药强度、减少药物的种类、同时改善中枢神经系统感染患者预后的作用相类似。在临床常用实验室指标方面,本研究结果表明,脑脊液常规、生化及外周血炎症指标变化对mNGS阳性的预测均无特异性。因此,如果从脑脊液常规、生化结果预测颅内感染病菌的倾向性仍需后续大数据研究支持。外周血指标与患者全身状况及感染状况息息相关,对颅内感染无特异性预测价值,这与目前大多研究[16-17]相符。脑脊液常规、生化在两组间差异无统计学意义。这可能与纳入患者包含颅脑外伤患者相关。颅脑外伤后脑脊液中红细胞明显增加,干扰脑脊液中常规细胞计数表达及脑脊液中蛋白质、离子表达相关。需结合患者临床表现综合分析方能诊断。这与Fu等[18]对脑室外引流及蛛网膜下腔出血后颅内感染患者诊断困难,需进一步融合指标建立对于颅内感染的预测模型一致。本研究显示,mNGS及常规培养对颅内感染的特异度及灵敏度差异有统计学意义,mNGS灵敏度较常规培养组高,但其特异度较常规培养组低,考虑与mNGS因其具有无靶病原检测的特性,理论上可检测样本中所有微生物信息,也可能出现检出多种病原体但无法确定致病病原体或无法确定是否与临床相符的情况[19]相关,mNGS高检出率导致无颅内感染组假阳性较高,从而导致特异度较常规培养组低,因此临床应用中仍需进一步关注。但常规培养病原微生物检出率低,且特殊病原体如真菌、结核等均不易检出。因此,mNGS对于颅内感染有一定诊断价值而常规培养未表现出明显的诊断价值。另外,与常规培养相比,mNGS对于真菌及寄生虫亦具有较高检出率。本研究也详细分析了颅内感染常见病原体种类,其中铜绿假单胞菌、粪肠球菌及嗜麦芽窄食单胞菌均检出率较高,且对鲍曼不动杆菌的检出与临床相符性极高,为临床经验性用药提供新思路。

4 结论

mNGS在临床的应用是值得推广的,但由于其价格较昂贵,限制了临床上的广泛重复应用。本研究可为临床颅内感染的患者治疗提供一定方向。但由于本研究纳入病例数有限,仍需进一步扩充病例来为临床医生的更加精准化治疗提供新思路。