基于16S rDNA 高通量测序技术分析不同身体质量指数儿童的肠道菌群结构差异

安静 郭会敏 孔蕊

随着社会经济的快速发展，人们生活水平的提高以及膳食结构也发生转变，近年来，我国居民肥胖人群明显增加，且儿童肥胖率的上升速度高于成年人，其中我国6 岁以下儿童超重率达到6.8%和肥胖率达3.6%［1-2］。肥胖本身是一种疾病，也是发生高血压、高血脂、胰岛素抵抗、糖尿病等多种慢性疾病的危险因素，其发生受遗传、环境、个体等多种因素的影响［3］。肠道菌群是在人体消化道的重要组成成分。目前有研究表示［4］，人体内的肠道微生物环境与脂肪、碳水化合物及氨基酸等物质的代谢息息相关，肠道菌群和肥胖症之间存在着一定的相关性。身体质量指数（body mass index，BMI）是目前临床评估和诊断肥胖最常用的指标，以体重和身高的比值进行计算，可间接反映人体脂肪成分的数量［5-6］。有研究报道表示［7］，BMI 与人粪便微生物群组成具有显著的相关性。为进一步探寻肥胖、不同身体质量指数与和肠道菌群结构的关联性，本研究基于16S rDNA 高通量测序技术分析不同身体质量指数儿童的肠道菌群结构差异，对肥胖进行分层和鉴别，分辨菌群结构不同与身体质量指数类型的聚类关系，为临床肥胖儿童针对性治疗和干预提供理论指导。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2020 年8 月至2022 年8 月82 例到许昌市中心医院进行健康体检的儿童作为研究对象，纳入标准：①年龄6～14 岁的儿童；②符合超重或单纯性肥胖的诊断标准［8］；③两个月内未使用抗生素、益生菌及其他肠道药物的儿童；④留取大便样本前2 周内无应激创伤、严重感染、便秘或腹泄等症状的儿童；⑤所有受试儿童其监护人均签署知情同意书。排除标准：①有先天性遗传代谢疾病、I 型糖尿病等基础疾病导致的代谢紊乱及中枢神经系统疾病的儿童；②有肾脏疾病或血管因素导致的高血压等的儿童；③患有其他重大疾病且无法进行相关检查的儿童。由本院医护人员统一对体检儿童的身高和体重进行测量，按照国际通用的BMI 计算方法对其身体质量指数进行计算［9］，即BMI=体重（kg）/身高（m）2。其中BMI 18.5～＜24 为正常组，BMI≥24 为肥胖组，根据其身体质量指数（BMI）分为正常组及肥胖组，正常组儿童50 名，其中男童28 名，女童22 名，平均年龄（8.03±3.78）岁；平均BMI（20.39±1.53）kg/m2。肥胖组32 例，男童19例，女童13 例，平均年龄（7.54±3.19）岁；平均BMI（26.69±1.53）kg/m2。两组患者的年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究已经医院医学研究伦理委员会审批同意。

1.2 方法

1.2.1 资料收集

采用问卷调查的方式对受试儿童的性别、年龄等资料进行收集，并现场对受试儿童的身高、体重及BMI 进行记录。

1.2.2 样本收集与储存

所有受试儿童均留取早晨新鲜粪便于无菌干燥采便盒内，并装入2 mL 试管，于液氮中储存，于4℃条件下冷藏，并在采集4h 内送到实验室-80℃冰箱处保存。

1.2.3 DNA 提取、PCR 扩增及测序

取适量样本至离心管中，使用无菌水将样本稀释至1 ng/μL，采用QIAamp DNA stool Mini kit 试剂盒提取总DNA。使用引物338 F5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA -3′ 和806 R 5 -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 对16S rDNA（16S ribosomal RNA gene）的基因的V4-V5 区进行后PCR 扩增制备测序文库进行高通量测序分析。每个样品DNA 均加上8 bp 的标签序列，重复扩增3 次。反应程序：95℃预变性2 min；然后进行25 个循环变性包括（95℃，30 s，55℃，30 s，72℃，30 s）；最后72℃充分延伸5 min。反应体系包括4 μL 的5 X FastPfu Buffer，2 μL 的2.5 mM dNTPs，引物（5 μM）各0.8 pL，0.4 μL 的FastPfu Polymerase 和10 ng 模板DNA，补双蒸水至20 μL；然后进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。在凝胶DNA 片段回收后，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 进行纯化，再QuantiFluorTM-ST 进行定量，然后在Illumina MiSeq 高通量测序平台进行测序。

1.2.4 数据分析

在测序原始数据下机后，首先对测序结果进行质控，然后通过对序列进行拼接、过滤和去嵌合体完成序列优化，最后进行OTU（operational taxonomic units）聚类。各个分类水平上进行群落结构的统计分析。采用Alpha 多样性分析正常组和肥胖组儿童微生物群落的丰度和多样性。

1.3 统计学方法

使用Qiime 软件对肠道菌群的丰富度和多样性进行分析，计算Ace、Chaol、Shannon、Simpson 指数。采用统计学软件SPSS 22.0 对数据进行处理。计量资料采用（）表示，行t检验；计数资料采用n（%）表示，行χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同身体质量指数儿童的肠道菌群组多样性指标分析比较

肥胖组的Ace 指数和Chaol 指数明显低于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；肥胖组的Shannon 和Simpson 指数较正常组低，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同身体质量指数儿童的肠道菌群组多样性指标分析比较（）Table 1 Analysis and comparison of diversity indexes of intestinal flora in children with different body mass index（）

表1 不同身体质量指数儿童的肠道菌群组多样性指标分析比较（）Table 1 Analysis and comparison of diversity indexes of intestinal flora in children with different body mass index（）

2.1 不同身体质量指数儿童的肠道菌群结构比较

儿童肠道微生物群落在门水平上排名的分别为：厚壁菌门＞拟杆菌门＞放线菌门＞变形菌门。肥胖组的变形菌门水平明显高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；但两组的拟杆菌门、拟杆菌属、乳杆菌属、志贺菌属、放线菌门、双歧杆菌属水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图1。

图1 不同身体质量指数儿童的肠道菌群结构分布特征比较Fig. 1 Comparison of structural distribution characteristics of intestinal flora in children with different body mass index

表2 不同身体质量指数儿童的肠道菌群结构比较（）Table 2 Comparison of intestinal flora structure of children with different body mass index（）

表2 不同身体质量指数儿童的肠道菌群结构比较（）Table 2 Comparison of intestinal flora structure of children with different body mass index（）

3 讨论

人体肠道菌群被称为“人类的第二基因库”［10］，肠道内定植超过1 000 种细菌，编码的基因数量是人类基因组的150 倍以上，且肠道菌群的种类、数量、结构与多种疾病相关。随着基因测序技术的发展，肠道菌群在人类疾病中的作用也逐渐被重视。肠道微生物群作为一个重要的“器官”，肠道菌群构成情况与宿主的机体的状态相关［11］，本研究通过16S rRNA 高通量测序分析不同BMI儿童的肠道菌群差异，筛选出标志菌群，可帮助揭示肠道菌群在肥胖、代谢综合征等疾病发生发展中作用和机制，为肥胖的治疗提供新指标和临床依据，最终实现临床辅助诊断及早筛。

本研究结果显示，肥胖组的Ace 指数和Chaol指数明显低于正常组，但肥胖组的Shannon 和Simpson 指数虽较正常组低，但两组的差异无统计学意义。Ace 指数和Chaol 指数均为评估群落丰富度的指标，而Shannon 指数和Simpson 指数是评估肠道微生物菌落多样性的指标；指数值分别与群落的丰富度和多样性呈正比的关系［12］。人体肠道菌群种类复杂，但大约有30～40 种占人体肠道菌群的90%，厚壁菌门和拟杆菌门为主要菌群，放线菌门和变形菌门次之［13-14］。厚壁菌门包含有乳杆菌属、胃球菌属等，其可将食物纤维分解成短链脂肪酸从而促进人体对食物的吸收从而增加能量的摄入，而拟杆菌等也可产生糖苷水解酶，将食物分解为单糖或短链脂肪酸，从而帮助人体对食物的分解与吸收［15］。本研究结果显示，肥胖组儿童的菌群的丰富度虽低于正常组，但两组儿童的菌群的多样性没有太大差异，可能是由于儿童肠道内菌群的组成大致相同，但不同的饮食习惯或其他因素导致两组儿童的菌群丰富度不同［16］。除此之外还有梭杆菌门、疣微菌门等重要菌群参与着人体肠黏膜上皮细胞的分化与增殖，共同维持着人体肠道免疫系统的稳定，但当人体的肠道菌群结构和组成失衡，或某类细菌数量出现变化时，则可能引发疾病的发生［17］。臧晓明等［18］也在研究中表示，不同BMI 人群的肠道菌群丰度及结构组成有明显差异，肠道菌群组成结构的不同和菌群丰度的差异可能是导致儿童BMI 变化的重要原因。

在本研究中，不同BMI 儿童的肠道菌群结构存在着差异，儿童肠道微生物群落在门水平上排名的分别为：厚壁菌门＞拟杆菌门＞放线菌门＞变形菌门，其中肥胖组的变形菌门明显高于正常组，但厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门比较无明显差异。Chen 等［19］的研究表明，肥胖鼠中的变形菌门存在丰富度提高的现象；李静等［20］也在研究中表示，肥胖儿童肠道菌群中有出现变形菌门菌群水平升高的情况，且变形菌门水平与BMI 水平存在一定的相关关系。这说明变形菌门水平升高可能与儿童肥胖的发生相关，变形菌门可能是BMI 升高的标志菌群。

综上所述，不同身体质量指数儿童的肠道菌群的丰度不同，肥胖儿童的肠道菌群的丰度明显较低，且肠道菌群结构组成有差异，变形菌门可能是BMI 升高的标志菌群，可能在儿童BMI 升高中发挥着重要作用。但由于本研究为单中心研究，且样本量较少，可能存在一定的地域限制。