环形泰勒虫分泌蛋白与其转化细胞互作研究进展

李 志,孟 茹,王淑琴,马怡隽,沈秀英,郭志宏,朵 红*

(1.青海大学/省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室/青海省动物疫病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室/青海省畜牧兽医科学院,青海西宁 810016;2．西宁市动物疫病预防控制中心,青海西宁 810003)

牛的环形泰勒虫病是由璃眼蜱的蜱传播的环形泰勒虫寄生于牛的单核巨噬系统细胞和红细胞而引起的血液原虫病[1]。该病主要在热带和亚热带国家发生和流行,每年造成110多万头牛死亡,损失达数亿美元[2]。在亚洲、非洲和南欧,大量的牛受到媒介蜱的感染;同时全球变暖造成媒介蜱分布范围扩大;再加上新发泰勒虫病原的生物学特性和经济重要性并未阐明,从而使该病的发生与流行愈加严重[3-5]。尽管抗泰勒虫药物-布帕伐醌和细胞弱毒疫苗在预防和控制该病过程中发挥了重要作用,但是目前已出现布帕伐醌抗性虫株,并且该疫苗需要冷链运输,同时疫苗免疫后宿主均为带虫状态[6]。因此,亟需对虫体分泌关键分子进行深入、系统研究,以期获得潜在药物靶点或者疫苗候选分子。

与其他顶复门寄生虫一样,环形泰勒虫也进化出了复杂的策略,重塑其在宿主细胞中的生态位,从而实现增殖和生存。然而,这种由媒介蜱传播的原虫是目前发现的唯一一类可诱导哺乳动物细胞发生永生化的真核生物,因此又被称为转化型泰勒虫。此类泰勒虫还包括小泰勒虫(T.parva)和莱氏泰勒虫(T.lestoquardi)。目前研究最多的是环形泰勒虫和小泰勒虫,前者可转化牛的巨噬细胞、B淋巴细胞和树突状细胞,而小泰勒虫能使宿主的T和 B淋巴发生永生化。尽管小泰勒虫和环形泰勒虫都可使牛的B淋巴细胞发生永生化,但是这两种虫体转化B细胞的机制是否一致仍有待探究。更重要的是,泰勒虫裂殖体转化的细胞具有癌细胞的某些细胞表型,如无限增殖、能量代谢失调、入侵和转移激活以及免疫逃逸[1]。在虫体感染宿主后可将裂殖体转化的细胞分离出来,进而建立体外培养细胞系。因此,体外永生化细胞系极利于在细胞水平和分子水平对虫体与宿主细胞的相互作用进行研究。同时,在体外用布帕伐醌处理泰勒虫转化的细胞后,伴随寄生虫的清除,宿主细胞转化特性随之消失,细胞停止增殖,恢复至正常的程序性凋亡,说明泰勒虫诱导的细胞转化具有可逆性特征[2],这为研究胞内寄生虫与宿主细胞的相互作用提供了强有力的模型。Witschi M等通过蛋白质组学技术鉴定了环形泰勒虫转化巨噬细胞后虫体蛋白组成,并对确定的虫体蛋白进行了分类和功能预测,为泰勒虫-宿主细胞的互作关系和细胞永生化研究提供了重要数据基础。之前的研究主要集中在泰勒虫劫持宿主细胞信号通路方面,尤其是细胞转化相关信号,如c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和宿主核因子c-Myc、核转录因子-κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)和激活蛋白1(activator protein-1,AP-1)等[7-8]。在本研究中,我们聚焦于已知的环形泰勒虫分泌蛋白与宿主细胞间的相互作用;并且这些已研究的分子可能是潜在的药物靶标,甚至疫苗候选基因,从而为牛泰勒虫病致病机制研究以及防控方面奠定基础。

1 环形泰勒虫表面蛋白

环形泰勒虫表面蛋白(T.annulatasurface protein,TaSP)是一个单拷贝基因,在虫体子孢子和裂殖体阶段均有表达。该蛋白含有3个跨膜区,且C端具有3个高度磷酸化的丝氨酸(S303,S304和S305),并且虫体转化细胞S期S303和S305的磷酸化程度远高于M期[9]。TaSP与宿主细胞的微管蛋白α和γ均发生相互作用,这表明该分子可能参与微管组装,从而在调控细胞有丝分裂过程中发挥重要作用。此外,近期研究发现,TaSP可与细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)结合;用CDK1抑制剂处理环形泰勒虫感染细胞后,可抑制虫体增殖,说明该蛋白可能参与细胞转化[10]。除与宿主细胞发生相互作用外,该基因也是环形泰勒虫病的诊断标识和亚单位疫苗候选分子[6]。

2 环形泰勒虫裂殖体表面蛋白p104

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白p104(T.annulatamajor schizont surface protein p104,Ta-p104)主要定位于环形泰勒虫的微线体。该分子结构高度无序,富含脯氨酸,含有SxIP、SH3基序以及泰勒虫感染的高频率结构域(domain of frequently associated inTheileriainfection,FAINT)。Woods K等[11]证明,Ta-p104将宿主末端结合蛋白1(end binding protein 1,EB1),蛋白招募至裂殖体表面,使其磷酸化进而调控微管动态;也发现宿主CLIP-170相关蛋白1(CLIP-170-associating protein 1,CLASP1)[12]、CD2相关蛋白(CD2 associated protein,CD2AP)[13]也与Ta-p104发生相互作用。尽管已发现,虫体分子Ta-p104、TaSP与宿主细胞微管具有紧密的关联,但是仍有许多问题有待解释,如在虫体感染的细胞中细胞分裂如何调控?尽管虫体增殖与宿主细胞分裂周期同步[32],但是宿主细胞有丝分裂过程中是否驱动虫体DNA的合成?在泰勒虫转化宿主细胞过程中可引起JNK信号通路持续激活,其中Ta-p104招募JNK2至裂殖体表面,形成复合体,抑制JNK2的功能,进而促进虫体增殖[14]。但是,该分子是否操控其他宿主细胞信号,进而维持细胞永生化状态尚不清楚。

3 环形泰勒虫脯氨酰异构酶1

环形泰勒虫脯氨酰异构酶1(T.annulataprolyl isomerase 1,TaPin1)是一个高度保守的分子,该蛋白具有肽基脯氨酸顺反异构酶结构域,分布于宿主细胞的胞浆和细胞核中;研究发现,TaPin1分子主要调控宿主细胞转录因子c-Jun和缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1 subunit alpha,HIF1α),进而引起细胞转化:1)TaPin1通过劫持含F-box/WT重复域蛋白7(F-box/WD repeat-containing protein 7,FBW7)泛素连接酶,激活c-Jun转录因子,调控onco-miR-155表达,促进宿主细胞增殖[7,15];2)TaPin1通过稳定M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase isoform M2,PKM2),激活HIF1α因子,促使葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)和己糖激酶(Hexokinase 2,HK2)表达,从而影响宿主细胞表型[2,16-17]。但是,TaPin1稳定宿主PKM2蛋白以及降解FBW7的分子机制尚不清楚。

4 环形泰勒虫富含脯氨酸的微管和SH域互作蛋白

环形泰勒虫富含脯氨酸的微管和SH域互作蛋白(T.annulataproline rich microtubule and SH-domain interaction protein,TaMISHIP)只在转化型泰勒虫中表达,含有一个信号肽序列和蛋白裂解位点,以及两个核定位信号序列和一个核输出信号序列[3,18]。在虫体子孢子阶段,TaMISHIP与p104部分共定位;在裂殖体阶段,TaMISHIP分子以点状形式表达,且与p104分布紧密相连[12]。Pull Down实验证明TaMISHIP与宿主CD2AP、CLASP1结合,同时免疫沉淀方法证实该分子与宿主EB1也存在较弱的相互作用[3,13,18]。因此,虫体与宿主细胞互作的复合物(EB1/CLASP1/p104/TaMISHIP/CD2AP)可能会通过其他方式招募宿主细胞分子至裂殖体表面,进而调控宿主细胞功能。

5 环形泰勒虫GPI锚定裂殖体蛋白34

环形泰勒虫GPI锚定裂殖体蛋白34 (T.annulataGPI anchored schizont protein34,Tagp34)是泰勒虫所独有的分子,因其蛋白分子质量为34 ku而得名。该分子是一个GPI锚定蛋白,以点状形式分布于小泰勒虫和环形泰勒虫裂殖体表面。和TaMISHIP一样,gp34在虫体感染和未感染细胞中都可转移至细胞核,诱导细胞双核化[18]。而在COS7细胞中,过表达gp34时,发现该蛋白定位于细胞中体和中央纺锤体,说明其可与微管发生结合[3]。有数据证明,gp34是微管调节器复合体CLASP1和EB1的组分,表明这两种蛋白可能在宿主细胞分裂过程中发挥作用。Huber S等[13]证明,gp34与宿主细胞CD2AP发生相互作用,进而影响虫体入侵。弓形虫可重新排列宿主的微管网络,以促进细胞内细胞器的重新排列,以利于虫体生存[18]。虽然此结论尚未在泰勒虫感染的细胞中得到证实,但是某些虫体分子有可能对宿主细胞器,例如内质网、高尔基体、线粒体或内溶酶体囊泡进行招募,进而实现其增殖。

6 环形泰勒虫分泌蛋白

环形泰勒虫分泌蛋白(T.annulatasecretory protein,TaSE)在转化型泰勒虫都有表达,是一个保守的单拷贝基因。该基因只在裂殖体和梨形虫阶段表达,而在子孢子阶段并不表达。而在裂殖体阶段,该蛋白在裂殖体内外层均有分布,并且在裂殖体表面表达[3]。TaSE可与宿主微管蛋白α-tubulin发生结合,因此TaSE可能在寄生虫和宿主细胞中都发挥着作用。

7 环形泰勒虫半胱氨酸蛋白酶

在顶复门寄生虫中,半胱氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族,分为9个亚类,可能在寄生虫毒力、宿主入侵、营养和宿主免疫反应中发挥着关键作用。在环形泰勒虫中,其半胱氨酸蛋白酶(T.annulatacysteine proteinase,TaCP)被归类为C1家族,C1A亚家族,并且在其催化中心无半胱氨酸残基。Zhao S等[19]通过酵母双杂交技术发现,TaCP可与宿主B细胞脑膜转录因X2 (cereblon transcript variant X2,CRBN)和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶4C(protein serine/threonine protein phosphatase 4,PPP4C)都发生相互作用,并表明TaCP可能参与调控宿主信号通路,但其具体机制尚不清楚。同时,该蛋白是否与宿主细胞其他分子发生结合仍有待解析。

8 环形泰勒虫环孢素蛋白1

与TaPin1一样,该蛋白是泰勒虫基因组中的另一个脯氨酸异构酶,只存在于转化型泰勒虫。该蛋白含有228个氨基酸,在其 N端含有一个信号肽序列和一个异构酶结构域。免疫荧光实验发现,该蛋白主要分布于环形泰勒虫裂殖体周围[20],表明其可与宿主细胞发生互作。酵母双杂交和Pull Down 技术证实,环形泰勒虫环孢素蛋白1(T.annulatacyclophilin1,TaCyp1)与宿主RNA聚合酶II亚单位21中介体(mediator of RNA polymerase II transcription subunit 21,MED21)蛋白发生直接相互作用,并且在虫体感染细胞中,通过SiRNA干扰宿主分子后,宿主细胞中NF-κB1/κB2 转录水平显著下降,而P105和P52基因水平并未发生变化[20],说明其他分子可能参与MED21的调控。但是TaCyp1分子在宿主细胞永生化过程中的分子基础仍是未知的。

9 环形泰勒虫亚端粒编码的可变蛋白多基因家族

小泰勒虫和环形泰勒虫基因组含有四条染色体,其中小泰勒虫基因组大小为8.3 mb,而环形泰勒虫基因组大小为8.5 mb;并且,在这两个转化型泰勒虫存在一个多基因家族,即环形泰勒虫亚端粒编码的可变蛋白多基因家族(T.annulatasubtelomere-encoded variable secreted proteins multigene family,TaSVSP-family)家族,此家族是泰勒虫基因组中最大的基因家族。在小泰勒虫中,该家族含有85个基因;而在环形泰勒虫中SVSP家族具有51个成员,重要的是,该家族基因具有进化中立、非典型密码子使用、核酸序列高度缺失和插入的特征,这就意味着SVSP分子间结构具有较大差异,可能参与不同的生物学过程。同时,先前研究发现,该基因家族大部分基因含有信号肽序列、PEST基序以及FAINT结构域,并且主要在虫体裂殖体阶段表达,这表明其可能在宿主细胞永生化过程中扮演重要角色。在U2OS细胞中,转染小泰勒虫SVSP基因(TP03-0882)后,发现其分布于细胞核,但在虫体感染细胞中,并未检测到该分子,说明该分子可能存在某种体内降解机制。关于该家族基因是否与宿主细胞发生互作及其作用机制研究很少,目前我们在环形泰勒虫中发现,SVSP449、SVSP454和SVSP455分子主要表达于虫体裂殖体阶段,并且在环形泰勒虫感染细胞的细胞核和胞浆中都有分布[21],说明上述分子可能与宿主细胞蛋白结合,从而执行其生物学功能。我们研究发现,虫体分子SVSP449与宿主细胞X-链接2-样RNA结合基序(RBMX2-Like:RNA binding motif protein-X-linked 2-like,RBMX2-Like)蛋白发生互作[22];SVSP454蛋白与宿主分子卷曲螺旋域181(coiled-coil domain 181,CCDC181)和线粒体核糖体蛋白L30(mitochondrial ribosomal protein L30,MRPL30)均具有相互作用[23];同时,也证明SVSP455与宿主细胞热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)发生相互作用,进而调控线粒体信号通路,有助于虫体生存[24]。虽对虫体几个SVSP蛋白与宿主细胞互作进行了探究,但是这些分子在泰勒虫诱导宿主细胞转化中的分子机制并不清楚。

10 环形泰勒虫裂殖体AT-hook蛋白家族

环形泰勒虫裂殖体AT-hook蛋白家族(T.annulata schizont AT-hook protein family,TashAT-family)含有17个基因,并且预测发现很多TashAT蛋白含有信号肽序列、DNA结合基序、核定位信号和FAINT结构域。虫体分泌的一些TashAT蛋白定位于宿主细胞核中,并且发现TashAT2蛋白可调控宿主细胞干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)表达。在环形泰勒虫中,TashAT的DNA结合域序列具有高度的一致性。然而,在小泰勒虫中并未发现DNA结合域同系物。那么在这两种虫体中这些蛋白是否与宿主细胞结合?在功能上是否存在差异?以及这些结构域在宿主细胞表型中扮演怎样角色?这些问题仍有待深入研究。

11 展望

在泰勒虫与宿主细胞互作研究中,一直存在着一个令人着迷的问题:哪些寄生虫分子(蛋白、脂质、RNA、其他因子)直接参与,或者对宿主细胞癌样化表型是必需的?尽管目前已解析了某些虫体分子可通过劫持宿主细胞信号进而维持永生化状态,但是这只是虫体功能蛋白的冰山一角。同时,截至目前环形泰勒虫中仍有近一半基因功能是未知的。因此,需结合先进的生物学方法,如液相色谱-质谱、高通量功能基因筛选技术以及生物物理学方法,同时,结合生物信息学技术,如AlphaFold2等对环形泰勒虫编码蛋白进行深入分析与研究。更重要的是,建立环形泰勒虫的Crispr-Cas基因编辑系统可为病原基因功能研究提供强有力的技术工具,可精确解析虫体关键分子在病原-宿主互作以及致病机制中的分子基础,同时为疫苗研发提供关键候选分子。