猪精液冻存技术研究进展

陈昱光,李云香,王 婵,李剑南,贺 鑫,雷安民

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100)

根据美国农业部(USDA)发布的数据显示,2021年世界生猪存栏量为74928万头,比2020年上升了15.16%;世界猪肉产量为10 610万t,与2020年相比上升10.81%;预计在未来的几年里,生猪的需求量将继续增长。为了满足市场的需求,除了扩大养殖规模外,对猪种进行不断地改良更应是努力的方向,在相同的养殖规模下,优良的猪种饲料转化率高、出肉率高,这意味着减少了过量的饲料需求和粪便产生对环境的负面影响[1]。作为可以帮助生猪养殖业改良生猪性状、提高生产效益、维护生猪遗传多样性的关键辅助技术,猪精液的冷冻保存一直是研究的重点和难点。

相较于液体保存的精液,冷冻保存的精液具有生物安全性、使用的灵活性以及国际贸易的优势,因此在理想情况下,冷冻保存的精液是猪授精的第一选择。此外,猪精子的冷冻保存技术也是长期保留高价值遗传资源的关键技术。但在猪冷冻保存精液的使用中发现,复苏后精子存活率较低、质量较差,这导致了在实际生产中出现授精率低、每胎产仔数达不到正常标准等问题,同时由于冷冻复苏后精子受损的影响,也难以保证能否完整保存优良种畜的性状,因此大大妨碍了冷冻保存技术在实际生产中的应用[2]。

1 猪冻精技术的应用现状

1.1 人工授精

人工授精是目前应用最广泛的猪育种技术,在发达国家育种方案中的应用率达90%以上[3]。最常用于人工授精的是液体储存的精液(包括低温保存的精液或鲜精),其繁殖性能较好,繁殖率高于90%,每头授精成功的母猪活产仔数可达到12头以上,与自然交配后获得的效果相似。

人工授精也可以用冷冻保存的猪精子,尽管冷冻复苏后精液的受精能力要比液体储存的精液低得多。由于猪精子细胞膜成分的特殊性,导致其冷冻复苏后猪精子复苏率和质量远低于牛、羊等其他大型牲畜,因此难以在生产上得到广泛应用。制约猪精液冻存技术发展关键因素在于,目前冷冻复苏机制猪精子损伤的机制并不完善,因此难以针对化的改良猪精液冻存配方[4]。

目前,养猪业的人工授精主要依赖于液体储存的精液。虽然冷冻精子在某些情况下也被使用,但全球猪基因交换的主要方法仍是通过活体动物的运输。运输活体动物的成本相对较高,还需要花费疾病预防测量等相关检疫费用,这限制了猪遗传信息在全球范围内的交换。而通过运输冷冻保存的猪精液,可以将成本和风险降至最低。

1.2 冻精技术

目前已有公司建立了猪精子冷冻保存的商品化方案,针对主流猪种,可以使复苏后精子活率达到76%～85%,但其妊娠率和每窝仔猪数量仍达不到鲜精的标准,不足以在生产实际中进行大范围应用,特别是中国地方猪种,其冻精复苏后存活率往往不足40%,这对我国的育种保种进程有一定的限制[5]。同时研究发现公猪之间个体的差异性对复苏后精子活力和质量影响显著。收集并冷冻长白猪的精液时,观察到存在30%公猪的精液在复苏后表现出非常低的活力。此外,即使是同一头猪,在不同的时间、年龄、季节对其精液的冷冻保存,复苏后也观察到精液质量存在显著差异。

1.3 种质资源的交换与保护

长期以来的市场需求决定了生猪养殖业对于料重比高、生长速度快、瘦肉率高的猪种的追求,导致了养殖企业对于品种猪的盲目引进与杂交利用,极不利于猪种遗传资源的保存与生态多样性的维护。探索出优良的猪精子冷冻技术与方案,能够大大降低优良品种猪的引进成本,同时也可以有效保存现有的各类猪种的种质资源。因此,猪冻精技术的建立,是加强全国猪种遗传资源保护、引进优良猪种及优良种猪育种的必要手段,是保证全国养猪业持续发展的基础和必要条件。

2 猪精子损伤机制的研究

2.1 冻融致猪精子损伤

冷冻复苏过程包括一系列可能改变细胞结构的步骤,会导致细胞膜受损、胆固醇流失、获能样变化以及DNA碎片化,还可能破坏二硫键导致核蛋白结构稳定性降低[9]。除了冷冻介质、温度和渗透压变化引起的负面影响外,冷冻复苏过程还会造成细胞内ROS失衡,引发脂质过氧化,使细胞发生凋亡样变化和DNA氧化损伤[10]。此外,冻融过程会破坏线粒体等细胞器,降低这些细胞器的活性,从而影响精子活力[11]。线粒体损伤也增加了活性氧的产生,且造成活性氧水平的升高程度因物种而异。

猪精子经历冻融后还会导致精子内肌动蛋白、丝裂霉素和溶质载体家族成员等关键蛋白的再分配和重新定位;损害膜离子通道相关蛋白的功能;并改变特定精子蛋白的酪氨酸磷酸化模式。

2.2 猪精子对ROS损伤敏感

与新鲜精液相比,低温保存(17℃)的猪精子和冷冻猪精子的受精能力较低。这是由于处理过程中的化学和物理变化,会影响细胞内氧化平衡。猪精子内,高水平ROS产生的病理效应的关键要点是造成不饱和脂肪酸(PUFAs)的过氧化[13]。研究表明,猪精子的质膜上富含不饱和脂肪酸,当大量的碳碳键被ROS氧化就造成了精子内脂质过氧化反应,这将直接导致猪精子凋亡样变化的出现[13]。

精子耐低温性与质膜的组成直接相关,特别是胆固醇/磷脂比率和磷脂部分饱和脂肪酸的丰度,因为这些成分决定了精子的膜流动性。例如,牛精子比猪精子表现出更高的弹性,这归因于牛精子中较高的胆固醇/磷脂比率(牛:0.45,野猪:0.26)和较低的蛋白质/磷脂比率(牛:0.80,野猪:1.26)[13]。猪精子细胞膜上含有大量的不饱和脂肪酸,更易在冷冻应激诱导的ROS代谢紊乱作用下发生脂质过氧化级联反应,导致细胞膜损伤并发生铁死亡,因此,猪精子质膜容易不稳定,易失去选择通过性,允许Ca2+、碳酸氢盐和培养基成分进入胞内[13],破坏细胞内稳态,促进蛋白质和mRNA的降解,降低精子的存活率[14]。

2.3 可能存在的调控机制

根据研究显示,细胞死亡过程通常受到不同基因的调控;例如,参与凋亡调控的一些关键基因是Caspases、TP53、FAS、BCL-2和BAX。调控铁死亡的基因包括GPx4、Nrf2、LSH、TFR1和SLC7A11。细胞坏死受到LEF1、RIP1和RIP3的调控,最后,自噬进程受到ATG5、ATG7、DRAM3和TFEB基因的调控[14]。因此,针对性的用细胞死亡相应调控基因的激活或抑制剂可以有效诱导或抑制细胞死亡进程。

近年来的研究发现,冷冻复苏所导致的细胞膜脂质过氧化失控与细胞铁死亡过程联系密切,是铁死亡过程的重要一环。以往的研究通常会将冻存复苏与猪精子凋亡联系到一起,但最近的研究显示,冻存复苏并未引起猪精子内DNA片段化和Caspase激活等凋亡现象[15],且凋亡抑制剂并不能缓解猪精子冻存损伤,但铁死亡抑制剂可以有效抑制膜脂质过氧化和精子死亡,或可以考虑冷冻复苏过程诱导了猪精子细胞铁死亡发生的可能性。

2.4 蛋白质组学与生物标志物制

精子功能验证的黄金标准是使卵子成功受精并发育为可存活的胚胎。想要准确判断冷冻精子的生殖潜能,需要更好地了解精子的功能。精子功能调控的分子机制对于优化冷冻精子处理方式和维持其生育能力至关重要。大多数与受精相关的分子机制都依赖于蛋白质的功能,这使得蛋白质组学成为生殖生物学中最强大的研究工具。因此,对精液蛋白质组学的研究是了解精子功能生物学和分析受精能力受损原因的必要条件。导致冷冻猪精子受精能力受损的潜在分子机制还不明确,精液蛋白质组学在解决这一挑战中可以发挥关键作用[29]。

精液蛋白,无论是来自精浆还是精子,都是衡量精子功能和生育能力潜在的生物标志物,因为它们在涉及到精子功能生物学的相关分子途径中发挥着关键作用。精液蛋白的任何定性和定量的改变都可能导致精子受精能力的丧失。研究发现顶体蛋白、纤维连接蛋白、热休克蛋白和电压依赖的阴离子通道蛋白水平与精子的低温耐受性呈正相关[16],而和三磷酸异构酶的蛋白水平呈负相关[29]。此外,评估冷冻保存对整个精子蛋白质组的影响也是优化冷冻过程的必要条件。最近发表的两项比较新鲜和冷冻复苏公猪精子蛋白质组学的研究显示,在新鲜精子和冷冻精子之间鉴定出41个定量不同的蛋白质,以及32个在超低温保存过程经历相关丰度变化的蛋白质[17]。这些结果清楚地表明,低温保存重塑了公猪精子的相应蛋白质,这也与其他物种哺乳动物中进行的研究结论相符合[18]。以上的结果都为冷冻精子受损机制的研究提供了潜在的标志物。当然,在这些发现应用于该领域之前,必须进行相应的验证,包括蛋白质印记(Western blot,WB)、ELISA等,以确保所鉴定的蛋白质可以作为可靠的生物标志物。

3 猪精子冷冻技术改善手段

3.1 前期处理时间

有研究表明,精子在收集后不立即冷冻,冷冻保存的结果会更好。冷冻前在15～17℃孵育持续3 h以上能够优化冻存效果,而这种优化处理的最佳时间段是10～24 h[19]。这一时期可以通过平衡或维持精子的脂质结构,从而有助于质膜的稳定。但精子在该时期变得更耐低温的详细机制仍未阐明,研究人员推测与热应激相关的精子蛋白(如热休克蛋白70)的磷酸化有关。

3.2 抗氧化剂

迄今为止,许多研究证实了在冷冻介质中补充抗氧化剂可以抵消ROS对精子的负面影响。现阶段绝大多数的研究集中于在猪精子冷冻介质中添加合成或天然抗氧化剂,这的确对维持猪精子功能产生了积极的作用。在整个精子冷冻复苏的步骤中,精子会在每个不同的温度变化阶段,包括从室温至17℃(冷冻前孵育阶段)、17℃至4℃(冷却步骤结束,冷冻步骤开始前)、从冷冻状态至37℃(解冻后),重新达到热平衡状态,在此过程中精子所处的液体环境和处理时间也有所不同,因此在开发新的精子冷冻复苏策略时,可以考虑在孵育液、解冻液以及授精培养基也添加抗氧化剂来进一步优化方案[20]。

3.3 冷冻保护剂

可渗透性冷冻保护剂有甘油、二甲基亚砜、乙二醇、甲醇、丙二醇和二甲基乙酰胺等[21]。其中甘油是猪精子的最佳渗透性冷冻保护剂,其最佳作用浓度在2%～3%之间[6]。蛋黄和乳糖则是最常见的不渗透性冷冻保护剂,用作猪精子的冷冻延长剂。在蛋黄提取物中发现的磷脂可以防止精子发生冷休克和Ca2+内流,而蛋黄的低密度脂蛋白部分表现出最好的低温保护功能。此外,使用表面活性剂,如 Orvus ES Paste,可以促进蛋黄蛋白与质膜的相互作用,当与蛋黄共用时可以改善精子冷冻效果[22]。但需要注意的是冷冻保护剂在常温下会对细胞的存活起到不利的影响,所以通常会在4℃平衡阶段加入以减少毒害作用。

3.4 精浆

通常精浆会在冷冻保存前被移除,因为研究人员认为精浆的存在会降低精子复苏后的存活率。然而,并不是所有来自精浆的蛋白质都对精子有害。有研究指出仅去除低分子量蛋白质(12～14 ku)可改善冷冻保存效果,而添加精浆中部分物质至冷冻介质中可增加冷冻精子的活力和膜完整性[23]。

复苏后加入精浆是否对精子有利存在对立的结果。一些研究人员指出,精浆对复苏后精子活力和膜完整性有积极影响,也有研究结果表明加入精浆后精子顶体和膜完整性下降[24]。这种矛盾的结果同样也出现在对复苏精子生殖性能的研究中,有研究表明复苏后添加精浆可提高精子生殖性能[25],而另外一些研究则显示这种处理无明显差异甚至有不利影响。这些矛盾的结果可能归因于添加精浆的比例,因为添加50%的精浆(复苏后4 h精子活力30%)效果明显比添加10%精浆(复苏后4 h精子活力20%)要更好[25]。

3.5 冻精的储存

虽然检测同批次冷冻效果好和效果差的猪精液后发现其脂质过氧化水平和复苏后ROS总量没有显著差异,但有报道称液氮存储会增加细胞内的ROS水平,这可能会对低温保存样品的寿命造成影响[26]。Li J等分别对冷冻储存2年,4年和8年的同一批猪精液质量进行评估,并与早期复苏结果(冷冻后15 d)进行比较。与冷冻后15 d复苏的精子样本相比,冷冻储存4或8年的精子样品中总精子活力有所下降。值得注意的是,研究结果表明多于2年的冷冻储存时间会对猪精子运动能力造成不利影响,因此在做人工授精时需要额外增加精液数量[26]。

4 讨论

目前用冷冻复苏的公猪精子进行人工授精多是作为品种改良的手段在养殖场中小范围使用[27]。猪精子冷冻保存的主要优点是可以储存来自优良性状公猪的遗传物质;构建种质库以防自然灾害(如猪瘟导致的大面积扑杀)所造成的遗传信息丢失;并且相较于鲜精和活体运输,冷冻保存的猪精子极大地促进了优良猪种遗传信息在国际之间交流的同时,也具备更高的生物安全性[28]。相信在不久的将来,冷冻保存的精子在实践生产中可以得到更广泛的应用。

最新的研究进展显示,冷冻复苏的猪精子进行人工授精后的生育结果已经得到了改善,但迄今为止,最先进的冻精技术依然避免不了低温保存对精子本身的负面影响,人工授精后效果达不到鲜精的标准。这主要是冻存致猪精子损伤的分子机制仍不明确所导致[29],未来猪精子冻存技术的改进,除了于冷冻精子所处液体环境中添加抗氧化剂外,或可将目光对准于冻存致精子细胞死亡的相关机理研究以及利用蛋白质组学技术阐明冻精受损的潜在分子机制上来。