化学衍生化技术在兽药残留检测中的应用

付雷明,张欣达,张 伟,李道稳,杨琳燕*,李 存*

(1.天津农学院动物科学与动物医学学院,天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室,天津 300392;2.天津市北大港湿地自然保护区管理中心,天津 300270)

畜牧业的快速发展,兽药在预防、治疗动物疾病及促进生长方面发挥着越来越重要的作用。兽药滥用导致的药物残留对环境安全、人类身体健康构成了严重的威胁。因而对兽药残留检测提出了更高的要求,因此建立快速准确的兽药残留检测方法具有重要意义。色谱法是兽药残留分析中常用的方法,但部分兽药的特性以及基质的复杂性导致难以被分离及检测。利用化学衍生化技术改变残留物的理化性质,使之宜于分离检测,目的通常有如下几种:①增强待测分析物稳定性,利于气相分析;②提高选择性,降低杂质的干扰;③加快反应速度,缩短反应时间;④提高检测灵敏度。本文综述了国内外化学衍生化技术在检测常见兽药残留的中的应用,在此基础上对其在兽药残留检测领域的应用进行展望。

1 化学衍生化技术

化学衍生化是将待测分析物与含有特定功能基团的衍生化试剂进行化学反应,生成含有特定功能的衍生化产物,通过衍生化产物间接测出待测物含量[1]。在衍生化过程中待测分析物的活性官能团被修饰,反应产物的溶解度、极性、沸点等理化性质随之改变,新的理化性质可以用来分离或量化。衍生化试剂通常由反应基团和改性增敏基团构成。反应基团与待测物中的特定基团发生化合反应,而改性增敏基团可以优化色谱行为、增加信号强度等。

1.1 衍生化试剂

根据衍生化试剂不同可分为硅烷化、烷基化、酰基化、荧光化、紫外化等。硅烷化是利用硅烷基取代羧基、巯基、氨基、亚氨基等基团中活性氢原子的化学反应,衍生产物为硅烷基醚或硅酯。最常见的试剂是三甲基甲硅烷基。色谱法中硅烷基化主要目的是降低分析物的极性,增加其稳定性。例如,壮观霉素和林可霉素是具有高沸点和强极性的高分子化合物,对其进行衍生化降低极性后可通过气相色谱(gas chromatography,GC)进行分析[2-3]。酰基化衍生除降低极性、提高挥发性外,还可用于取代分析物中的活性氢,使分析物的分子量升高,以增加电子捕获检测器(electron capture detector,ECD)的灵敏度[4]。酰化通常用于带有ECD或质谱(mass spectrometry,MS)检测的GC以提高响应。烷基化衍生使用烷基类基团取代分析物中的活性氢。如利用三甲基甲硅烷基重氮甲烷衍生化使青霉素G挥发,以达到气相色谱串联质谱(gas chromatography tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)分析条件[5]。

1.2 衍生化技术的常见类型

1.2.1 柱前衍生化 在色谱之前进行衍生化反应称为柱前衍生。柱前衍生法具有试剂消耗量低、反应速度快、选择性和分辨率高等特点。可与多种检测器联用,不需要复杂的仪器设备。衍生化反应产物中可能会存在未能发生反应的衍生化试剂残留,但因分析是在通过色谱柱分离后进行的,所以对结果影响甚微[6]。柱前衍生化可选择衍生化试剂较多,已被广泛应用于多种生物基质中的兽药残留分析。房艳等[7]采用柱前衍生结合荧光检测法测定牛奶中乙酰氨基阿维菌素残留量,简化了复杂的前处理过程,提高了产物回收率及增加了反应速率。Rashed N等[8]采用柱前衍生化结合紫外检测法用于快速测定蜂蜜中头孢噻呋,无需提取或预处理步骤,检测限(limit of detection,LOD)为3.29 ng/mL,定量限(limit of quantification,LOQ)为10.97 ng/mL。

1.2.2 柱后衍生化 与用于增强目标分析物的分离程度或提高检测灵敏度的柱前衍生法不同,因已经发生分离,柱后衍生避免了与目标分析物共洗脱可能产生的干扰,仅用于增强待测物。来自色谱柱的洗脱液与衍生化试剂进行混合,将分析物转化为具有不同理化性质(紫外-可见吸光、荧光)的物质,从而提高灵敏度和特异性[9-12]。柱后化学衍生反应在兽药残留分析中主要以荧光分析为主。

1.2.3 微波辅助衍生化 在分析物为极性物质的情况下,微波所携带的能量可以明显缩短衍生化时间,以达到快速分析的目的。微波辅助衍生化具有设备简单易得、可重复性高等特点。Xu X等[13]将微波辅助衍生化与分散液萃取技术相结合分析牛奶样品中的氨基糖苷类药物得到了较高的精密度。微波辅助衍生结合固相萃取技术对海产品中的硝基呋喃代谢物做到精确定量分析[14]。该方法因采用微波辅助衍生化技术,使衍生化反应在20 min以内完成,极大缩短了衍生化时间。

1.2.4 超声辅助衍生化 超声辅助衍生化是一种新型绿色方法,近年来有相关文献报道该技术应用在有机、无机分析等不同领域[15]。超声辅助衍生化加速不溶两相之间的物质传递效率,从而缩短衍生时间以达到提高衍生效率的目的[16]。该方法具有所需设备易得、操作简单、节省时间等特点。Yu F等[17]使用超声辅助浊点萃取法 (ultrasonic assisted cloud point extraction,UA-CPE)对蜂蜜样品中磺胺类药进行分析,缩短了分离时间并且获得了更高的回收率。Silveira A L 等[18]采用超声辅助衍生法对牛尿液中的类固醇进行分析,显著缩短了衍生化时间并减少了衍生化试剂的使用。

1.2.5 光化学衍生化 光化学衍生化是所有衍生化方法中最环保、通用、直接的,也是在兽药残留分析中最常用的衍生化方法。光化学衍生的原理是利用待测分析物在特定的条件下吸收紫外光引起其性质或结构发生变化,形成荧光增强的现象。这种方法与紫外-可见分光光度法,电化学,化学发光,荧光法等传统的检测方法相结合,提升了选择性与灵敏度,广泛应用于药品或食品分析领域[19]。将紫外光化学衍生化结合在线柱后衍生可实现对鸡肉和鸡蛋中8种磺胺类抗生素的快速分析[20]。利用光化学衍生也可实现对动物乳制品中黄曲霉毒素的定量分析[21],与其他方法相比具有更高的灵敏度,避免了使用危险的氯化溶剂,进一步降低了检测成本。

2 衍生化技术在兽药残留分析中的应用

色谱技术是兽药残留检测的基本手段。然而由于兽药种类繁多,不同类型的兽药理化性质有显著差异,部分兽药残留物不利于使用色谱分离检测。通过化学衍生化技术将其定量转化为易于色谱检测的化合物,以达到可被检测或增加检测灵敏度的目的。

2.1 青霉素类

青霉素G是一种天然窄谱抗生素,抗菌作用很强,用于治疗各种敏感病原体所致感染。在家禽养殖业主要用于控制禽流感和治疗家禽卵巢炎。适当合理的使用青霉素G可以刺激畜禽生长及提高饲料利用率。青霉素G在养殖行业中常被部分企业和个体养殖户滥用,直接导致畜禽产品兽药残留超标。由于青霉素的化学结构不包含强生色团或发光团,因此液相色谱(liquid chromatography,LC)通常结合质谱或紫外检测器,但较低的波长(接近或低于250 nm)可能会受到来自样品基质的背景信号的干扰,所以很少有使用LC测定青霉素的报道。Castillo M L等[22]采用波长较长的铈类化合物作为柱后衍生化试剂,降低了来自样品基质背景信号的干扰,实现了对6种青霉素类抗生素定量分析。因青霉素G的非挥发性,Liu C[5]在使用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)时用重氮甲烷对青霉素进行衍生,增加了青霉素G的挥发性,用于检测禽蛋中青霉素G的含量, LOD和LOQ分别为1.70～3.20 μg/kg和6.10 ～8.50 μg/kg。

2.2 酰胺醇类

氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素在内的酰胺醇类药物为广谱抗生素,能够抑制革兰氏阳性菌和阴性菌,曾被广泛应用到畜牧业和水产养殖业中[23]。但因其可能会抑制骨髓造血机能,食用动物中禁止使用氯霉素[24]。甲砜霉素会抑制红细胞的生成,氟苯尼考具有胚胎毒性[25]。直接使用GC技术分析氯霉素类化合物非常困难,部分原因是这类分析物会吸附在色谱柱的涂层上。因此,需要对氯霉素类化合物进行衍生化以适应GC分析。Liu W L等[26]将衍生化试剂直接引入萃取室,以避免基质和甲硅烷基化试剂之间的副反应,大大提高了衍生化效率。Yikilmaz Y等[3]将三甲基甲硅烷基化合物作为衍生化试剂与分析物中的羟基反应,成功用于鲑鳟鱼中的氟苯尼考残留测定。鲑鳟鱼中氟苯尼考的LOD和LOQ分别为1.64 μg/kg和4.9 μg/kg。

2.3 磺胺类

磺胺类药物具有广谱抑菌活性,在兽医临床领域主要用于防治畜禽的微生物感染、球虫病等。磺胺类的药物残留是一个非常重要的问题,因为这类药物具有致癌性并且易产生耐药性。当磺胺类药物在人体内蓄积超过一定浓度,会导致肝肾、泌尿系统等损伤,甚至某些磺胺类药物可能导致癌变。磺胺类药物没有发光团,将含有发光基团的衍生化试剂与其本身含有的光化学活性基团反应,产生带有荧光物质衍生产物,从而可用荧光检测器直接检测[27]。Zotou A等[28]用荧光胺作为衍生化试剂进行柱前衍生,用于同时测定鸡蛋和鸡肉中12种磺胺类药物,在鸡肉和鸡蛋样品中LOD分别为2 μg/kg～17 μg/kg和2 μg/kg～15 μg/kg。在牛奶的常规检测过程中,大部分样品不会受到磺胺类药物的污染。Dmitrienko S G[29]等开发了一种“是/否”二元响应检测法,该方法基于磺胺与对二甲基氨基肉桂醛形成紫红色缩合产物的比色反应,用于磺胺药物的定量和肉眼半定量筛选。这种方法可以在常规条件下每天以极低成本检测大量样品。王晓茵等[30]将磺胺类药物与荧光胺进行衍生,应用于猪肉中11种磺胺类药物测定,有效降低其他组分的干扰,提高检测的灵敏度和可靠性。目前磺胺类药物与荧光胺的衍生化产物性质不稳定,容易分解,解决这类问题是今后开发新型衍生化试剂所努力的方向。

2.4 氨基糖苷类

氨基糖苷类是一类广谱抗生素,用于治疗细菌感染或促进生长,在我国畜牧生产行业广泛应用。由于氨基糖苷的耳毒性和肾毒性,其在食用动物组织残留可能给人体健康带来严重的危害。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)是测定氨基糖苷类的主要分析方法。由于氨基糖苷类不包含发色团和荧光团,通常需要进行衍生化。将氨基糖苷类分析物与衍生化试剂反应生成带有紫外或荧光吸收的衍生产物,进而进行紫外或荧光检测。房亮等[31]用邻苯二甲醛与链霉素进行衍生化反应,生成具有特定波长紫外吸收的衍生产物,采用紫外-分光法检测牛奶中残留的链霉素。与传统高效液相色谱法对比该方法操作简单、检测速度更快而且检测费用低。Xu X等[13]采用微波辅助衍生化结合荧光检测器用于测定牛奶样品中的氨基糖苷类药物,妥布霉素、新霉素、庆大霉素的LOD在0.11～0.50 ng/mL。该方法检测氨基糖苷类药残留与传统方法相比具有快速、简单、环境友好等特点。

2.5 喹诺酮类

喹诺酮类药物是一类人工合成的广谱杀菌性抗菌药物。氟喹诺酮类是第三代喹诺酮类药物,其具有广谱、高效、低毒性以及与其它抗菌药物无交叉耐药性等特点,已经广泛应用于兽医临床领域,在维持动物福利方面发挥着重要作用。但这类药物的残留会对人类健康造成一些不良影响,例如过敏性超敏反应、毒性作用以及抑制敏感菌群破坏微生物动态平衡。Yánez-Jácome G S等[9]采用氧化铽纳米粒子作为柱后衍生试剂用于牛奶样品中七种喹诺酮类药物残留的测定。此方法改进了样品前处理流程,仅需简单的脱蛋白步骤,并且缩短了色谱分离时间。Xia Q等[32]采用二恶唑对氟喹诺酮进行衍生,改变目标分析物的极性提高了检测灵敏度,提高超声辅助浊点萃取(ultrasonic assisted cloud point extraction,UACPE)效率。四种氟喹诺酮类药物的LOD在0.2～0.4 μg/kg。

2.6 头孢菌素类

头孢噻呋为第三代动物专用半合成头孢菌素。具有广谱抗菌、耐青霉素酶、低毒、临床疗效高等优点。广泛用于治疗家禽、奶牛和蜜蜂等呼吸道细菌感染,在全球范围内用于治疗呼吸道疾病。极低剂量下可能引起部分人群发生过敏反应,并且可能在人类病原体中产生耐药菌株[33]。Rashed N等[8]使用1,2萘醌4磺酸盐与头孢噻呋中的一个伯氨基反应以产生分光光度法可检测的衍生物,LOD为3.29 ng/mL。El-Rabbat N A等[34]将头孢吡肟与Hg(I)离子进行衍生,提高了选择性并增加了灵敏度,成功用于分析复杂基质(山羊血浆和牛奶)中的头孢吡肟。

2.7 阿维菌素类

阿维菌素类药物是畜牧兽医业中防治寄生虫的首选药物,包括伊维菌素、多拉菌素、阿维菌素等。这类药物的优点是有效剂量小,但因其较高的脂溶性,导致体内残留时间长,以被世卫组织列为高毒化合物[35]。虽然阿维菌素具有能实现紫外吸收的共轭二烯结构,但受限于紫外检测的低灵敏度和低选择性并不能满足检测需求[36]。因此对阿维菌素进行荧光衍生成了近些年来的主要研究方向。谭梅[37]等对农业部标准中的高效液相色谱法进行优化,为了提高了衍生化效率增加冰乙酸和三乙胺两种衍生试剂。在衍生产物中加入甲醇,使产物更加稳定。在奶牛养殖业中,乙酰氨基阿维菌素是的第一个不需要休药期的广谱抗寄生虫药。毒理学试验表明,不能排除其对人类健康的潜在威胁。最新生效的GB 31650-2019对乙酰氨基阿维菌素最高残留限量做出了规定。房艳[7]等将酰化试剂三氟乙酸酐和催化剂氮甲基咪唑和进行混合衍生,得到含有荧光活性的乙酰氨基阿维菌素衍生产物。该方法方便快捷,满足牛奶中痕量残留的检测要求。张玉洁[36]等着重对衍生化反应过程中的温度、时间及光照参数进行优化,使其在牛、羊奶中的LOQ均为0.5 μg/kg。

2.8 硝基呋喃类

硝基呋喃是一类人工合成广谱抗菌药物,曾被广泛应用于畜禽及水产养殖。这类药物和其代谢产物有致突变、致畸、致癌等可能,我国规定动物性食品中不得检出硝基呋喃。尽管法律禁止,但由于其抗菌活性高且成本低,硝基呋喃仍在使用。硝基呋喃类药物会在动物体内迅速代谢,其代谢物会存在几周,因此通常检测其代谢物。尽管现存多种检测方法,但由于硝基呋喃类代谢物有很高的极性,使得很难从反相色谱柱上分离。而且这些代谢物的分子量低且不含发色团,紫外和质谱检测器对其灵敏度较低。Melekhin A O等[38]使用5-硝基-2-糠醛作为衍生剂,结合液相-质谱串联技术(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)用于测定蜂蜜中四种硝基呋喃代谢物,LOD为0.1～0.3 μg/kg。Luo X等[14]合成了一种新型衍生化试剂,结合微波辅助衍生法,对虾中4种硝基呋喃代谢物同时快速测定,可在7.2 min内完成,节省了大量时间、试剂和材料的消耗。卢义博等[39]针对硝基呋喃类代谢物的胶体金免疫层析法(gold immunochromatographic assay,GICA)存在的缺陷,对不同基质样品进行水解并衍生化。提高了检测准确率,满足胶体金快速检测需要。四种硝基呋喃类代谢物的LOD都为0.50 μg/kg。

2.9 β-肾上腺素受体激动剂

盐酸克仑特罗俗称瘦肉精,具有增强肌肉和减少脂肪堆积的特性,在畜牧业中常被非法使用,导致了许多中毒事件。因盐酸克仑特罗是一种非挥发极性化合物,不能直接通过GC分析。因此,需要通过衍生化来改变盐酸克仑特罗的极性和挥发性。Ye D等[40]采用六甲基二硅氮烷作为衍生化试剂结合GC-MS分析猪肉中的克仑特罗,极大地缩短了分析时间。莱克多巴胺是一种典型的β肾上腺素能激动剂,喂养动物可以促进营养物质重新分配到肌肉中,增加平均日增重,提高饲料效率,增加氮保留并减少上市天数。在美国和部分国家用作猪、牛和禽类的饲料添加剂。莱克多巴胺的滥用导致药物残留,可能对消费者健康构成威胁。鉴于莱克多巴胺的潜在副作用,中国和欧洲的一些国家已经禁止在食品动物中使用莱克多巴胺作为饲料添加剂。Ding G等[41]用4-氯-3,5-二硝基三氟化物对莱克多巴胺进行衍生为紫外检测器提供足够的灵敏度,LOD和LOQ分别为0.045 μg/kg和0.149 μg/kg。带有紫外检测器的HPLC具有稳定性高、通用性强及维护成本低等特点,在大多数实验室中比GC-MS、LC-MS、LC-MS/MS和UPLC-MS/MS 更有优势。

3 展望

化学衍生化技术是提高样品分离效率和增加分析灵敏度的常用方法,在兽药残留分析领域得到了广泛的应用。化学衍生化技术的缺点就是在样品制备过程中多了额外的步骤,增加了试剂的种类和时间的消耗,但诸如超声波辅助、光化学衍生、微波辅助衍生等新技术的出现,以及稳定、专一、活性高的新型衍生化试剂的开发,为减少试验时间及环境污染等问题提供了新的可能。此外,与昂贵的质谱检测器相比经过衍生化后使用紫外、荧光等低成本检测器也能满足分析要求,大大降低了残留检测成本。未来随着绿色、高效的新型衍生化试剂和新方法的开发,化学衍生化技术将在兽药残留分析领域达到更广泛的应用。