羊源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

王进峰,李 颖,韩若龙,吕 妮,岳 登

(1.铜川市动物疫病预防控制中心,陕西铜川 727000;2.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;3.铜川市农业科技信息站,陕西铜川 727000)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)是一种革兰氏阴性、无芽孢、无鞭毛的兼性厌氧的致病性短杆菌,呈两极浓染,中间浅的特点,属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属细菌,它是危害养殖业的重要致病菌,能够引起多种动物出现呼吸道疾病,可感染猪、牛、羊、兔、鸡等多种动物和人,是一种重要的人兽共患病原菌[1]。

2022年11月陕西某奶山羊场羊出现精神沉郁,采食量减少,体温升高,个别羊出现呼吸困难,严重者死亡,剖检可见病死羊实质器官变性,淋巴结肿大、充血,心包积液,含多量纤维素渗出物。本研究无菌采集病死奶山羊肝脏、肺脏组织进行细菌分离、形态学观察、生化试验、药敏试验、致病性试验及PCR鉴定,旨在为奶山羊疾病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料为2022年11月无菌采集于陕西一规模化奶山羊场病死奶山羊的肺脏及肝脏组织。

1.1.2 试验动物 5周龄雄性昆明小鼠10只,体重25 g,购自西北农林科技大学实验动物中心。

1.1.3 主要试剂 普通营养培养基,TSA营养培养基,血琼脂培养基,南京诺唯赞生物科技有限公司产品;厌氧肉肝汤,中海生物科技有限公司;DNA Marker DL 2 000,2×TaqMasterMix,南京诺唯赞生物科技有限公司产品;各种染色试剂,细菌微量生化反应管,抗菌素药敏片,杭州滨和微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 SHA-X恒温摇床,上海智胜分析仪器制造有限公司产品;SW-CJ-IBU超净工作台,上海博讯实业有限公司产品;TC-5000 PCR仪,Techne有限公司产品;电泳仪(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司产品;细菌浊度仪,杭州齐威仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与形态学观察 将无菌采集的肝、肺组织病料接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、血琼脂培养基中,置37℃恒温厌氧培养12 h后观察菌落形态及生长情况;并挑取疑似菌落进行染色镜检,观察其染色情况及形态特征;用接种环挑取血琼脂平板上疑似的单菌落,接种于厌氧肉肝汤培养管中,37℃恒温培养12 h,对疑似菌落进行纯培养。

将培养菌株接种于TSA固体培养基中37℃恒温培养12 h;同时接种于厌氧肉肝汤液体培养基中,37℃厌氧培养12 h,分别观察,并进行革兰氏染色,在光学显微镜下观察[2]。

1.2.2 生化试验 在无菌条件下,用接种环挑取TSA固体培养基上的典型菌落分别接种于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、吲哚、氧化酶、硫化氢、尿素、甲基红等生化培养基上,37℃培养48 h,观察记录结果,并根据微生物鉴定系统说明书进行鉴定。

1.2.3 16S rRNA基因的扩增 挑取TSA琼脂培养基上纯培养的细菌,使用煮沸法提取细菌DNA;PCR反应体系20 μL:2×TaqPCR MasterMix 10 μL,上、下游引物各1 μL(表1),DNA模板2 μL,ddH2O 6 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,共30个循环;72 ℃延伸8 min。将PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物,送至擎科生物工程(上海)股份有限公司测序,将测序结果与NCBI数据库中参考菌株16S rRNA进行Blast同源性比对。选取同源性较高菌株的16S rRNA基因序列,应用Mega 7.0软件构建系统进化树[3]。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.4 药敏试验 无菌挑取分离纯化的细菌接种于TSB液体培养基上,置于37℃摇床中(180 r/min)培养12 h,吸取100 μL的菌液于TSB培养基上,并将其涂布均匀,然后用无菌镊子将各种药敏片分别平放在培养基表面, 保持纸片间距离适度,37℃温箱培养24 h。观察结果并测量抑菌圈直径,根据抑菌圈直径判定分离菌对药物敏感性。抑菌环直径判定依据杭州天和微生物试剂有限公司产品说明书:抑菌圈直径≥17 mm,为高度敏感;14 mm≥抑菌圈直径<17 mm,为中高度敏感;抑菌圈直径<14 mm,为耐药。

1.2.5 小鼠致病性试验 将分离纯化的细菌接种于血清肉汤培养基中,37℃、220 r/min恒温摇床培养12 h,通过平板计数并调整菌液浓度为1×108CFU/mL,每个小鼠腹腔注射0.2 mL,注射5只小鼠,对照组小鼠注射等量的营养肉汤[4]。分别隔离饲养两组小鼠,观察小鼠临床表现,死亡小鼠及剖检并观察病理变化,无菌采集肺脏进行细菌分离鉴定。

2 结果

2.1 细菌分离培养

从肝、肺组织中分离到1株菌,将分离纯化的细菌接种于TSA培养基上呈现出贫瘠的细小、透明、露滴状菌落;在麦康凯培养基上不生长;在鲜血琼脂培养基上生长良好,呈现出白色、圆形、光滑水滴状的小菌落;三糖铁培养基上生长出较小菌落,且使三糖铁培养基颜色变黄;在厌氧血清肉汤中,开始轻度混浊,4～6 d液体变清朗,管底出现黏稠沉淀,振摇后不分散,表面形成菌环;革兰氏染色镜检,分离菌均为红色、两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌,,散在或成对存在,说明分离菌兼性厌氧。

2.2 生化试验

根据细菌微量生化反应管试剂盒操作规范对分离菌进行生化特性鉴定,葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、触酶、鸟氨酸脱羧酶试剂管反应均呈阳性,麦芽糖、乳糖、吲哚、枸橼酸盐、硫化氢、尿素、甲基红反应均呈阴性。结果见表2,与《伯杰氏细菌鉴定手册》中多杀性巴氏杆菌的生化特性一致,因此初步确定分离菌株为多杀性巴氏杆菌。

表2 分离株的生化特性Table 2 Biochemical characteristics of isolates

2.3 细菌16S rRNA基因序列分析结果

分离菌株16S rRNA PCR检测,产物经琼脂糖凝胶电泳,结果显示880 bp 左右的特异性条带(图1),与目的条带大小一致。将PCR扩增产物序列上传GenBank,用Blast进行对比,与多杀性巴氏杆菌(登录号:OQ253475)序列同源性为99%,综合分析并构建系统进化树(图2),进一步确定分离菌株为多杀性巴氏杆菌。

M.DNA标准DL 2000;1.分离菌株;2,3.阳性对照;4.阴性对照M.DNA Marker DL 2000;1.Isolated strain; 2,3:Positive control; 4.Negative control图1 菌株16S rRNA基因PCR结果Fig.1 PCR results of strain 16S rRNA gene

YBS.本次试验所得分离菌株YBS.The isolate obtained in this test图2 基于16S rRNA构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA

2.4 药敏试验结果

药物敏感性检测结果见表3。分离菌对羧苄西林、哌拉西林、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、庆大霉素等抗菌药敏感,对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、红霉素等抗菌药耐药。

表3 分离菌的药物敏感性试验结果(抑菌圈直径/mm)Table 1 The results of antimicrobial susceptibility test (inhibition zone diameter/mm)

2.5 小鼠致病性试验

试验组小鼠接种分离菌株12 h出现精神沉郁、采食活动减少、颤抖等临床症状,24 h后小鼠全部死亡,对照组小鼠状态良好。

对试验组小鼠进行剖检可见攻毒小鼠的肺脏出血严重,肝脏肿大并且有淤血、腹腔有纤维素液体渗出,对照组小鼠剖检未见异常病理变化。对试验组小鼠肺脏和肝脏组织进行细菌分离培养,从中分离到该致病性菌株,而从对照组小鼠中未获得,说明分离得到的多杀性巴氏杆菌具有致病性。

3 讨论

多杀性巴氏杆菌是羊常见的细菌性病原菌,为革兰阴性杆菌,需氧或兼性厌氧[5]。本菌作为一类条件性致病菌[6],具有潜伏能力强、养殖过程难以清除、人兽共患等诸多风险,严重威胁公共卫生安全并给畜牧业造成巨大经济损失。本菌可引起多种动物呼吸道疾病[7],例如禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、兔鼻瘘和出血性败血症,它在同种或不同种动物间也可相互感染,还可以通过动物抓咬、皮肤损伤等感染人类。多杀性巴氏杆菌病潜伏期短、呈散发或地方性流行、传播速度快、死亡率高。多发于牛羊[8],临床症状主要表现为高热、肺炎、内脏器官广泛性出血[9],幼龄羊感染后发病较严重,而成年羊多呈隐性感染[10],发病较少。幼羊剖检病变主要为胸腔积液和肝脏淤血,有灰白色米粒大小的坏死灶等症状。

本研究从病死羊肝脏组织中分离到疑似致病菌。将分离菌进行革兰染色、生化特性鉴定并将其16S rRNA序列与羊多杀性巴氏杆菌属同种的16S rRNA构建系统进化树。结果显示,其与OQ253475.1:24-743亲缘关系最近,可确定其为多杀性巴氏杆菌;药敏试验结果表明,可有效筛选出防治该菌株的抗生素。小鼠致病性试验结果显示试验组的小鼠全部死亡并出现肺炎症状,并且从肺组织中分离到相同的病原菌,说明分离菌株具有较强的致病性。本研究从奶山羊病例中分离到多杀性巴氏杆菌,并对其进行了致病性和药敏试验,为羊多杀性巴氏杆菌病的防治提供参考。