枯草芽孢杆菌在鱼片保鲜中的应用

张雯，陈淑俣，游佳鸿，倪 莉

（福州大学 食品科学技术研究所 福建省食品生物技术创新工程技术研究中心 福州 350108）

水产品是蛋白质和其它必需营养物质的重要来源，深受消费者的喜爱。然而，水产品中蛋白质含量丰富，易引起微生物的大量滋生，导致产品腐败变质。常用的水产品保鲜方式主要是低温保鲜和化学保鲜[1]，而生物保鲜逐渐成为趋势[2]。采用微生态保鲜剂进行保鲜，成本低，极具发展前景[3]。枯草芽孢杆菌对鱼肉、农产品具有防腐保鲜的效果。刘奎等[4]发现枯草芽孢杆菌发酵液可提高猕猴桃采后果实品质并延长果实货架期。经过枯草芽孢杆菌抗菌物质处理的虾肉，能够延长2～3 d 的冷藏货架期，减缓腐败细菌对虾肉蛋白质等含氮物质的分解[5]。目前，主要针对枯草芽孢杆菌抗菌肽的研究，如枯草芽孢杆菌可通过产生表面活性素、细菌素等多种抑菌物质拮抗细菌或病原菌生长[6]。而课题组前期研究[7]发现，将枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂喂养罗非鱼，可延缓冰鲜罗非鱼腐败，其主要机理是枯草芽孢杆菌可通过与黏膜上皮细胞黏附成膜，从而在机体内定植[8]，调节肠道微生物群组成，以防止致病微生物定植于上皮细胞而导致宿主感染[9]。以上说明利用益生菌的生物膜形成特性来抑制腐败菌定植，是研究鱼体保鲜的一个新途径[10]。本研究探讨枯草芽孢杆菌的生物膜形成能力对鱼片保鲜的影响，为枯草芽孢杆菌作为微生态保鲜剂提供新思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与菌株

试验所用枯草芽孢杆菌分离于罗非鱼体或鱼池，经过16S rRNA 和生理生化鉴定[11-12]，筛选得到16 株枯草芽孢杆菌用于后续试验。腐败菌为假单胞菌（Pseudomonas spp.）L1、L2、L3，为福州大学食品科学技术研究所前期从罗非鱼体中分离并鉴定，4 ℃保藏于牛肉膏蛋白胨斜面培养基。试验所用鲜活罗非鱼购自福州超市。

试剂及 微生物 培养基：NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、Na2CO3、NaHCO3、乙醇、琼脂粉、牛肉浸膏、十二烷基硫酸钠（SDS），国药试剂公司；异硫氰酸荧光素（FITC），吉至生化公司；胰蛋白胨、细菌学蛋白胨、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基，海博生物公司；结晶紫，西陇化工公司。以上试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

试验仪器及设备见表1。

1.3 试验方法

1.3.1 枯草芽孢杆菌特性表征

1）枯草芽孢杆菌生物膜形成能力测定 参考张雯等[13]对细菌生物膜的检测，并做适当修改。取过夜培养的枯草芽孢杆菌培养物经8 000 r/min离心沉淀10 min，将沉淀物用生理盐水重悬3 次后制备OD600nm值为1.0±0.05 的菌悬液。在无菌操作台将上述菌悬液与灭菌后的新鲜牛肉膏蛋白胨液态培养基按照体积比1∶10 混匀，然后取200 μL 至酶标板中，在37 ℃条件下静置培养24 h。

培养结束后弃菌液并添加200 μL 无菌PBS冲洗，重复2 次。在室温环境下晾干，然后加入200 μL 0.1%的结晶紫染色液染色15 min，弃染色液并用无菌去离子水冲洗4 次后，充分晾干，再加入95%的乙醇，将染色后的枯草芽孢杆菌充分溶解，从溶解液中取150 μL 放入新的96 孔酶标板中，空白组为空的酶标板，通过多功能酶标仪检测各孔的OD590nm。

2）枯草芽孢杆菌表面疏水性测定 参考张雯等[13]对细菌表面疏水性的测定。枯草芽孢杆菌的表面疏水率计算公式：

式中，A0——与二甲苯混匀前水相吸光度；A1——与二甲苯混匀后水相吸光度。

3）枯草芽孢杆菌自凝聚率测定 参考Rahman 等[14]对细菌自凝聚率的测定。枯草芽孢杆菌的自凝聚率计算公式：

式中，SR——静置t 小时枯草芽孢杆菌的自凝聚率（%）；A0——枯草芽孢杆菌初始的OD600nm；At——枯草芽孢杆菌静置t 小时的OD600nm。

4）枯草芽孢杆菌与假单胞菌的共凝聚率测定 取过夜培养的枯草芽孢杆菌培养物经8 000 r/min 离心沉淀10 min，将沉淀物用生理盐水重悬，并调OD600nm值为0.5±0.02。枯草芽孢杆菌和假单胞菌各取150 μL 菌悬液在96 孔酶标板的同一个孔中，30 ℃孵育4 h 后，用酶标仪测定混合菌液的OD600nm值。每组3 个平行，以300 μL 单种菌液为对照。

共凝聚率计算公式：

式中，X——枯草芽孢杆菌的共凝聚率（%）；SC——假单胞菌单独孵育4 h 的OD600nm值；LC——枯草芽孢杆菌单独孵育4 h 的OD600nm值；S+L——混合菌孵育4 h 后的OD600nm值。

1.3.2 枯草芽孢杆菌抑菌能力测定

1）枯草芽孢杆菌对假单胞菌的对峙抑菌率测定 将枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养皿中央，30 ℃培养12 h，以枯草芽孢杆菌为中心画十字，周边间隔1 cm 点种腐败菌继续培养36 h，记录最外层（A1）和最内层（A2）腐败菌的直径均值。所用的指示腐败菌为假单胞菌L1、L2、L3。对峙抑菌率的计算公式为：

2）枯草芽孢杆菌上清液对假单胞菌的抑菌率测定 取过夜培养后的培养液8 000 r/min 离心10 min，取上清液过0.25 μm 的滤膜制成无菌上清液。将OD600nm值为0.7±0.02 的腐败菌10 μL 分别加于1 mL 牛肉膏蛋白胨液态培养基中，试验组加入80 μL 的枯草芽孢杆菌上清液，对照组不加上清液，并在30 ℃下培养16 h，酶标仪测定OD600nm。所用的指示腐败菌为假单胞菌L1、L2、L3。计算公式：

式中，C1——对照组的OD600nm；C2——试验组的OD600nm。

1.3.3 枯草芽孢杆菌对罗非鱼片的保鲜能力

1）无菌鱼片及菌悬液的制备 将新鲜罗非鱼去除内脏并用无菌水冲洗干净，在无菌操作间用吸水纸去除鱼体表面的水分，用无菌解剖刀取背部鱼肉并均匀切成厚薄均匀、质量约为（2.0±0.02）g 的鱼片，在无菌操作室紫外照射消毒20 min 后得到无菌鱼片，备用。

分别从营养琼脂斜面培养基中挑取已活化的枯草芽孢杆菌和假单胞菌，划线接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃，200 r/min 摇床培养12 h，得到细菌种子液。将枯草芽孢杆菌和假单胞菌种子液以5%接种量接种于新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃，200 r/min 摇床培养24 h 得到发酵液，离心去除上清后，用生理盐水调整菌液浓度调至108CFU/mL，得到细菌菌悬液。在20 mL假单胞菌菌悬液中加入10 mL 的枯草芽孢杆菌菌悬液，供试验组鱼片用。在20 mL 假单胞菌发酵液中加入10 mL 生理盐水，供空白组鱼片用。将制备好的鱼片放入上述30 mL 菌悬液中浸泡20 s，取出沥干30 s，置于无菌均质袋中密封，4 ℃贮藏，每24 h 取样，均质备用。

2）挥发性盐基氮测定 参考《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》（GB 5009.228-2016）[15]中的方法。称取均质后的鱼肉样品（10.00±0.01）g 于蒸馏管中，加入75 mL 蒸馏水，振荡混匀，浸渍30 min。自动凯氏定氮仪参数设置：硼酸接收液30 mL，蒸馏时间3 min。往蒸馏管中加入1 g 氧化镁轻质粉末，连接凯氏定氮仪，开始蒸馏。蒸馏结束，用0.0100 mol/L 盐酸标准溶液滴定硼酸接收液，混合指示液的终点颜色为紫红色。TVB-N 计算公式：

式中，Y——样品的TVB-N 含量（mg/100g）；V1——实验组样品消耗的盐酸体积（mL）；V2——空白组消耗的盐酸体积（mL）；c——标准盐酸溶液的浓度（mol/L）；m——样品的质量（g）。

3）挥发性物质测定 参考王雪锋等[16]的方法并适当修改，称取（2±0.02）g 鱼肉放入15 mL 萃取瓶中，加入搅拌子和5 mL 饱和NaCl 溶液，加入200 μL 原始质量浓度为2 mg/L 的内标2，4，6-三甲基吡啶，拧紧瓶盖，置于60 ℃水浴中平衡5 min，将萃取针插入样品瓶中进行顶空吸附，萃取30 min。萃取结束后，将萃取针插入GC 进样口，解吸3 min 后拔针。在优化的内标物浓度下，结合内标物与风味物质积峰面积的比例，计算化合物的浓度，计算公式如下：

式中，Ai——挥发性组分i 的峰面积；A——内标物的峰面积；C——内标质量浓度（mg/L）。

1.4 数据处理

结果均以 “平均值±标准差” 表示，采用GraphPad Prism 6.0 软件进行制图，SPSS 32.0 软件中的Duncan 检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌生物膜形成能力分析

研究表明益生菌黏附定植于机体上皮细胞表面形成膜菌群，发挥生物屏障作用，抑制有害菌的黏附[17]，因此益生菌的生物膜形成能力越强，其抵御能力越强。各枯草芽孢杆菌菌株的生物膜形成能力如图1 所示，根据生物膜形成能力差异，将16 株枯草芽孢杆菌分类为：低成膜性枯草芽孢杆菌B10、B2、B5、B9、C2，中成膜性枯草芽孢杆菌C4、B6、C5、B3、C1、B7、B4 和高成膜性枯草芽孢杆菌C3、B1、B8、C6，并进一步选取高成膜性菌株C6、B8，中成膜性菌株B3、C5，低成膜性菌株B2和B10 进行鱼片的保鲜能力研究。

图1 枯草芽孢杆菌的生物膜形成能力Fig.1 Biofilm formation ability of Bacillus subtilis

2.2 枯草芽孢杆菌对鱼片的保鲜作用

将6 株枯草芽孢杆菌接入被假单胞菌L1 污染的罗非鱼片中，评估不同成膜效果枯草芽孢杆菌在鱼片低温贮藏期间的保鲜能力。采用挥发性盐基氮（TVB-N）为鲜度指标，并使用GC-MS 分析了鱼片挥发性气味的变化。

2.2.1 枯草芽孢杆菌对罗非鱼片中挥发性盐基氮的影响 以鱼肉的挥发性盐基氮（TVB-N）为保鲜指标，鱼肉的保鲜终点为30 mg/100 g[18]。由表2 可知，相比假单胞菌组（L1），枯草芽孢杆菌降低了鱼片中TVB-N 的含量，且高成膜性枯草芽孢杆菌C6、B8 效果最为显著。

表2 罗非鱼片中挥发性盐基氮的含量Table 2 Content of the TVB-N in tilapia fillets

2.2.2 枯草芽孢杆菌对罗非鱼片中挥发性气味的影响 鱼体腐败风味化合物是贮藏过程中腐败细菌作用和其发生化学反应产生的代谢产物。对比不同枯草芽孢杆菌处理后的鱼片挥发性风味物质的变化情况，进一步分析鱼肉的鲜度变化。根据TVB-N 指标确定第3 天为低温贮藏罗非鱼片的鲜度终点，采用GC-MS 测定第3 天鱼肉的挥发性成分。如表3 所示，假单胞菌L1 处理后的鱼片主要产生醇类、杂环类、酚类和酸类等风味化合物，加入枯草芽孢杆菌后，这些化合物产生的种类及数量均下降。高成膜性的枯草芽孢杆菌C6 和B8作用效果最为明显，显著抑制了鱼肉中醇类、酸类、酯类和酚类等挥发性气味的产生。进一步采用PCA 分析，如图2 所示，贮藏3 d 后，不同处理组挥发性风味物质具有差异，且与枯草芽孢杆菌的成膜性密切相关：高成膜性菌株C6、B8 位于第4象限，中成膜性菌株B3、C5 位于第3 象限，低成膜性菌株B2 和B10 位于第1，2 象限，且成膜性最低的B2 与假单胞菌L1 组共同位于第1 象限。位于第1 象限的B2 和L1 组特征风味为苯酚、吲哚、异戊醇、乙醇、苄醇、乙酸、N-二乙基二硫代氨基甲酸甲酯、棕榈酸甲酯等挥发性风味化合物。其中，苯酚具有典型的塑料橡胶味[19]，吲哚具有浓郁的粪臭味，是腐败鱼主要腥臭味的来源[20]。乙醇、苄醇和异戊醇等具有辛辣刺激味，而乙酸带有刺激性的酸臭味[21]。N-二乙基二硫代氨基甲酸甲酯和棕榈酸甲酯等酯类则带脂肪油蜡味，也是酸败味的重要组成成分[22]。高成膜的枯草芽孢杆菌C6组主要风味特征为葵醛、十四烷和2-十三烷酮。葵醛稀释后具有橙子的香气[23]，而饱和烃类，如十四烷、2-十三烷酮的气味温和不明显。由此可见，假单胞菌主要导致了腐败气味，而随着枯草芽孢杆菌的加入，风味特征开始转变为温和的气味，且效果随着生物膜形成能力的增强而逐步提高，C6处理组效果尤为显著。

图2 枯草芽孢杆菌对罗非鱼片贮藏期间挥发性成分的作用主成分分析图Fig.2 Principal component analysis（PCA）biplot plot of the effect of Bacillus subtilis on volatile compounds in tilapia fillets during storage

表3 不同枯草芽孢杆菌对鱼肉保鲜的挥发性气味含量（mg/L）Table 3 The volatile odor content of different Bacillus subtilis for fish preservation（mg/L）

2.3 枯草芽孢杆菌生物膜形成能力和抑菌能力对保鲜能力的影响

由于许多枯草芽孢杆菌菌株都能产生抑菌活性物质，因此将其抑菌能力、成膜能力与保鲜能力进行相关性分析，判断枯草芽孢杆菌发挥保鲜作用的主要途径。结果如表4 所示，生物膜形成能力与保鲜能力最为相关，对假单胞菌L1 的对峙抑菌率的相关性次之，而枯草芽孢杆菌上清液抑菌能力则与保鲜能力呈线性负相关。结果表明生物膜形成能力是影响枯草芽孢杆菌保鲜能力的关键指标。众多研究表明，成膜能力较强的益生菌占据定植位点进而抑制了病原菌对宿主的入侵、定植与破坏[24]。本研究说明，枯草芽孢杆菌的成膜能力同样也对腐败菌发挥了类似作用，从而延长了鱼肉的保鲜期。生物膜形成能力同时受到群体感应系统的影响[25]，对水产品腐败起到重要的调控作用[26]。例如，具有群体感应抑制效果的香芹酚与常规抑菌剂鱼精蛋白复合，其可有效延缓大菱鲆鱼片品质的劣变，可起到协同保鲜作用[27]。研究表明枯草芽孢杆菌具有群体感应信号淬灭的作用，从而减少腐败菌生物膜的形成[28]。同时，枯草芽孢杆菌对假单胞菌对峙生长的抑制与发酵液抑菌的区别在于对峙试验同时反映了对生物被膜形成的抑制，而发酵液抑菌更多体现对菌体的杀灭和生长破坏作用。因此，枯草芽孢杆菌对假单胞菌的对峙生长抑制能力与保鲜作用也存在较高相关性，也进一步推测成膜能力高的枯草芽孢杆菌通过占据黏附位点、产生更多猝灭信号等机制抑制了假单胞菌在鱼片上的滋生。

表4 枯草芽孢杆菌生物膜形成能力、抑菌能力与保鲜能力的相关性分析Table 4 Correlation analysis of biofilm formation，bacteriostasis and preservation ability of Bacillus subtilis

2.4 枯草芽孢杆菌生物膜形成能力相关指标

生物膜形成的第一步是细菌的黏附，细菌黏附的过程会受到范德华力、疏水作用、自凝聚率等菌体表面物理性质的影响，从而影响细菌生物膜的形成。为了能快速筛选得到保鲜用菌，本研究对枯草芽孢杆菌的疏水能力、自凝聚力、生物膜形成能力和共凝聚力进行测定，并与成膜能力进行相关性分析，找出最显著相关的因素。

由表5 可知，枯草芽孢杆菌的自凝聚率与生物膜形成能力最为相关，可作为筛选枯草芽孢杆菌生物膜形成能力的重要指标。同时，表面疏水性与自凝聚率相关性极其显著，研究表面，一般疏水性越强的益生菌，其自凝聚能力越好[29]，而疏水能力越强的细菌对宿主黏膜的定植效果也越强[30]，这些物理相互作用在菌株成膜定植的过程中发挥重要作用。

3 结论

本研究利用枯草芽孢杆菌对罗非鱼肉片进行保鲜。试验结果表明，枯草芽孢杆菌的生物膜形成能力越强，对罗非鱼肉的保鲜效果越强。生物膜形成能力强的枯草芽孢杆菌可显著降低鱼肉中的挥发性盐基氮含量，且能显著抑制鱼肉中醇类、杂环类、酚类和酸类等挥发性风味成分的产生，保持鱼片良好的水产鲜味。同时，自凝聚能力与生物膜的相关性较高，而抑菌能力和保鲜能力没有显著的相关性。枯草芽孢杆菌的自凝聚能力和生物膜形成能力是筛选其作为生物保鲜剂的重要指标。本研究为枯草芽孢杆菌作为生物保鲜剂提供了新思路。