基于网络药理学与动物实验探究肉苁蓉总苷对炎症性肠病的作用机制

闫文杰，冯 朵，2，张绍时，周士琦

（1 北京联合大学生物化学工程学院 生物活性物质与功能食品北京市重点实验室 北京100023 2 农业农村部食物与营养发展研究所 北京 100081）

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一种特殊的、病因尚不明确的慢性肠道炎症性疾病，包括两种亚型：克罗恩病（Crohn's Disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）[1]。截止2017 年，全球有680 万人被诊断患有IBD，全球发病率和患病率逐年增加，北美、西欧IBD 患病率较高[2-3]。1990—2019 年中国IBD 发病率从1.45/10 万上升到3.62/10 万，总体上升幅度为149.66%；死亡率从0.47/10 万下降至0.33/10万，总体下降幅度为29.79%[4]。随着中国人口老龄化，老年患者高发病率的小幅增加会对医疗卫生保健系统造成巨大的负担。

有研究证明，饮食调节有助于减轻IBD 患者的腹痛或腹泻等症状，减轻其并发症；还可调节肠道微生物组成和功能，影响肠道稳态，维持肠道平常功能[5]。肉苁蓉作为一种具有悠久历史的食药同源植物，在传统中医药中被广泛应用于肠道疾病的治疗，也被认为具有多种保健功效，因此在保健食品领域备受关注[6-7]。2020 年，肉苁蓉（荒漠）被列为食药同源物质，开展生产经营试点工作[6-7]。肉苁蓉作为食品，在日常生活中可起到预防IBD 的作用；作为药材食用，可在IBD 治疗过程中起到缓解病症的作用，具有一定的经济价值和药用价值。有学者发现荒漠肉苁蓉水提物能刺激免疫系统，调节免疫活性，预防炎症性肠病[8]。Jia 等[9]发现从肉苁蓉中提取到的松果菊苷（Echinacoside，ECH）可改善DSS 诱导的小鼠结肠炎；ECH 可通过刺激肠上皮细胞增殖、上调TGF-β 来预防细胞死亡并改善黏膜组织修复作用[10]。ECH 还可通过抑制mTOR/STAT3 通路表达水平，缓解LPS 诱导的大鼠肠上皮细胞凋亡和炎症[11]。此外，毛蕊花糖苷可作为机体自由基清除剂，减缓2，4-二硝基苯酸（2，4-Dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS）诱导的大鼠结肠炎进展，减少组织损伤[12]。

网络药理学是一门综合了生物信息学、生物化学、药理学和计算科学等多个领域的交叉学科，其利用大数据、生物信息学和计算工具，分析和模拟生物体内的复杂药物代谢、作用机制和药效预测，为新药研发和现有药物的优化提供了重要支持[13-14]。网络药理学的核心是建立药物与生物体内分子之间的网络模型，以揭示药物与靶标蛋白、代谢途径、细胞信号通路等之间的相互关系[15]。随着科学技术的不断进步，网络药理学将继续在医药领域发挥重要作用，为改善患者的生活质量和健康做出贡献。

有研究发现肉苁蓉总苷能够有效抑制LPS 诱导的BV2 细胞的炎症反应[16]，具有抑制肝癌进展[17]、保肝护肝[18]、改善记忆认知[19-20]、抗衰老[21]等作用。目前，肉苁蓉总苷对炎症性肠病的作用还鲜有研究报道。本研究基于网络药理学与动物实验探究肉苁蓉总苷对炎症性肠病的作用机制，为其治疗IBD 的临床应用提供新的方法和思路。

1 材料与仪器

1.1 试剂

葡聚糖硫酸钠（DSS，相对分子量36 000～50 000），美国MP 公司；尿粪隐血测试盒，南京建成生物工程研究所；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；二甲苯，上海凌峰化学试剂有限公司；PBS 缓冲液、RNA 提取液、第一链反转录试剂盒、2×实时定量PCR 扩增的预混合溶液、RTQPCR 引物，武汉赛维尔生物科技有限公司；无菌无酶水，美国HyClone 公司。

1.2 主要仪器与设备

KZ-Ⅲ-FP 型低温研磨仪，武汉赛维尔生物科技有限公司；CT15RE 型高速离心机，日本HITACHI 公司；CFX 荧光定量PCR 仪，美国Bio-rad公司；SW-CJ-1FD 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；NanoDrop2000 超微量分光光度计，德国Thermo 公司；FBZ2001-up-p 标准试剂型纯水仪，青岛富勒姆科技有限公司；INFINITE M NANO 型多功能酶标仪，瑞士TECAN 公司，UV-1600 型紫外分光光度计，上海美普达仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 网络药理学分析

2.1.1 肉苁蓉活性成分 在已有研究[7，22]的基础上，选择“Echinacoside”“Verbascoside”“Cistanoside A”“Tubuloside A”“Isoacteoside”“2-Acetylacteoside”“Tubuloside B”作为分析生物活性成分。通过Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）找 出上述7 种成分的三维化学结构数据，存为sdf 格式。

2.1.2 潜在作用靶点的预测与筛选 将活性成分的三维结构文件分别导入PharmMapper 数据库（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html），靶点物种选择“human protein targets only”，其余选项保持默认，得到不同成分对应的相应目标靶点。采用UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）获取每个靶点对应的蛋白名称和基因名称信息。将7 种成分对应的目标靶点合并。

在GeneCards 数据库中（https：//www.genecards.org/），以“inflammatory bowel disease”为关键词检索与炎症性肠病相关的基因，整理检索结果。

2.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein，Interaction，PPI）网络构建 使用jvenn（https：//jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html）在线绘制韦恩图，获取肉苁蓉活性成分靶点和IBD 的靶点交集。将得到的交集靶点上传到String 数据库进行PPI 筛选分析。下载PPI 网络的TSV 文件，导入Cytoscape 3.8.0，计算蛋白互作网络中度（degree）值，再依据degree 值大小对PPI 网络图进行美化。

2.1.4 基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 使用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对 肉苁蓉活性成分对IBD 发挥保护作用的靶点进行GO 分析，再用DAVID 数据库对肉苁蓉活性成分对IBD 发挥保护作用的靶点进行KEGG 通路富集分析。

2.1.5 肉苁蓉“活性成分-靶点-通路”网络构建将肉苁蓉的活性成分，肉苁蓉活性成分与IBD 的交集靶点和KEGG 富集的通路构建活性成分-靶点-通路网络。

2.2 动物模型验证

2.2.1 动物模型建立 使用SPF 级雄性BALB/c小鼠（5～8 周，18～21 g），由北京联合大学应用文理学院保健食品检测中心提供【实验动物使用许可证号：SYXK（京）2017-0038】，饲养于SPF 级动物房中，温度（23±2）℃，相对湿度50%～70%，日光灯照射12 h 交替昼夜。动物实验方案均获得北京联合大学应用文理学院保健食品检测中心动物实验室批准。将20 只小鼠适应性喂养3 d 后，按体质量随机分为4 组，每组5 只。①对照组（CZ）：自由饮用无菌水，灌胃无菌水，连续7 d；②DSS 对照组（DZ）：自由饮用每日现配3%DSS 液，连续7 d；③肉苁蓉总苷低剂量组（LZ）（药液浓度：0.1 g/mL）：自由饮用每日现配3%DSS 液，灌胃药液，连续7 d；④肉苁蓉总苷高剂量组（HZ）（药液浓度0.4 g/mL）：自由饮用每日现配3%DSS 液，灌胃药液，连续7 d。连续造模7 d 后断食12 h，颈椎脱臼处死。处死前4 h 腹腔注射鸡红细胞，处死后立即摘眼球收集血液，抽取腹腔积液后打开腹腔。测量结肠长度，取小鼠脾脏、派氏结等器官。

2.2.2 疾病活 动指数（Disease activity index，DAI）每日固定时间灌胃前称小鼠体质量，观察小鼠精神状态、粪便性状，测定粪便隐血情况，并进行相应评分，评分标准见表1。

表1 DAI 评分表Table 1 Scoring criteria of DAI

DAI 评分=（体质量评分+粪便性状评分+粪便隐血评分）/3（1）

2.2.3 实时荧光定量PCR 检测免疫信号通路（qRT-PCR）检测 收集小鼠脾脏，剪切成0.5 cm大小的组织块，浸泡在组织RNA 稳定保存液中存放。取出组织切块，加入RNA 提取液并研磨粉碎，提取其总RNA。经反转录、PCR 扩增，检测小鼠脾脏中mTOR、TGF-β 两个关键免疫信号通路激活情况。qRT-PCR 所用引物序列见表2。

表2 引物序列表Table 2 Primer sequence table

2.2.4 PICRUSt2 功能注释 采用CTAB 或SDS方法提取样品的小鼠粪便基因组DNA，之后用琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA 纯度和浓度。随后取适量DNA 于离心管中，用无菌水稀释至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA 为模板，根据扩增区域选择使用带barcode 的特异性引物、New England Biolabs 公司的含GC 缓冲液的高保真PCR 混合物和高效高保真酶进行PCR 扩增，以确保扩增效率和准确性。

PCR 产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。根据PCR 产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳再次检测。对目的条带使用Qiagen 公司提供的胶回收试剂盒进行回收。

根据16S rDNA 扩增子测序结果，基于Greengene 数据库中的ASV tree 和ASV 的基因信息，推断它们共同祖先的基因功能谱。同时对Greengene 数据库中其它未知物种的基因功能谱进行推断，构建古菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱。最后将测序得到的菌群组成映射到数据库中，进行菌群代谢功能预测。

3 结果与分析

3.1 肉苁蓉总苷靶点与疾病靶点分析

将活性成分的三维结构文件分别导入PharmMapper 数据库，得到不同成分对应的相应目标靶点。采用UniProt 数据库获取每个靶点对应的蛋白名称和基因名称信息。将7 种成分对应的目标靶点合并，共得到354 个靶点。在GeneCards 数据库中，以“inflammatory bowel disease”为关键词检索相关的基因，整理检索结果，最终获得7 851 个靶点。使用jvenn 在线绘制韦恩图获取肉苁蓉活性成分靶点和IBD 的靶点交集，如图1 所示，得到肉苁蓉活性成分对IBD 有防护作用的靶点254 个。

图1 活性成分靶点与炎症性肠病（IBD）疾病靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of active ingredients targets and IBD targets

3.2 PPI 网络构建

将得到的交集靶点上传到String 数据库进行PPI 筛选。如图2 所示，不同颜色节点分别代表肉苁蓉中的活性成分和IBD 相关靶点，边代表活性成分和作用靶点相互作用关系，颜色越深代表其节点越重要。该网络共包括227 个节点，这些节点相互作用产生917 个蛋白互作边，平均度值为7.25。根据Cytoscape 3.8.0 插件CytoHubba 分析网络中的核心靶点。如图3 所示，排名前30 的核心靶点包含有PTK2、PIK3R1、JAK2、表皮生长因子受体（EGFR）、KDR、非受体酪氨酸激酶（SRC）、HSP90AA1、丝氨酸/酸酸激酶1（AKT1）、STAT1、PTPN11 等。

图2 交集靶点蛋白互作（PPI）网络图Fig.2 PPI-network diagram of common targets

3.3 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析

使用DAVID 数据库对肉苁蓉活性成分对IBD 发挥保护作用的254 个靶点进行GO 分析（P〈0.05），共获得283 条生物过程（Biological process，BP）、79 条细胞组分（Cellular component，CC）、166 条分子功能（Molecular function，MF）数据，再利用微生信在线平台（http：//bioinformatics.com.cn/login/）对Count 值排名靠前的10 位进行富集分析。如图4 所示，肉苁蓉活性成分干预IBD 参与的BP 有信号传导（Signal transduction）、蛋白质磷酸化（Protein phosphorylation）、凋亡过程负调控（Negative regulation of apoptotic process）、RNA聚合酶II 启动子转录的正调控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、蛋白质水解（Proteolysis）、先天免疫反应（Innate immune response）、细胞增殖的正向调节（Positive regulation of cell proliferation）、细胞分化（Cell differentiation）、DNA 模板的转录正调控（Positive regulation of transcription DNA-templated）、细胞对外源性刺激的反应（Response to xenobiotic stimulus）。CC 主要有胞液（Cytosol）、细胞质（Cytoplasm）、核（Nucleus）、质膜（Plasma membrane）、Extracellular exosome、Extracellular region、核浆（Nucleoplasm）、Extracellular space、薄膜（Membrane）、线粒体（Mitochondrion）。MF 主要有蛋白结合（Protein binding）、相同蛋白结合（Identical protein binding）、ATP 结合（ATP binding）、金属离子结合（Metal ion binding）、锌离子结合（Zinc ion binding）、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性（Protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、酶结合（Enzyme binding）、蛋白质同源二聚活性（Protein homodimerization activity）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（Protein tyrosine kinase activity）。

图4 GO 功能富集图Fig.4 Enrichment analysis diagram of GO

使用DAVID 数据库对肉苁蓉活性成分对IBD 发挥保护作用的254 个靶点进行KEGG 通路富集分析，共获得161 条通路。将肉苁蓉的活性成分，肉苁蓉活性成分与IBD 的交集靶点和KEGG富集的通路构建活性成分-靶点-通路网络。如图5 所示，最左侧是肉苁蓉，左侧第1 个圆圈为肉苁蓉活性成分，右侧圆圈为交集靶点对应筛选出的富集通路，中间矩形部分是交集靶点。由该图可以推测，肉苁蓉活性成分可能通过作用于IL2、mTOR、ADH、CAS、SMAD、MAPK、NF-κB 等靶点来调控癌症通路、mTOR 通路、TGF-β 通路、JAKSTAT 通路、AMPK 通路等，进而影响细胞信号传导、增殖、分化、凋亡等。

3.4 肉苁蓉总苷提高DSS 诱导的DAI 评分

试验结果表明，除CZ 组外，其余3 组均有不同程度的体质量减轻和粪便隐血情况（图6）。其中，DSS 对照组体质量减轻率最高，粪便血情况最严重，DAI 最高，第6 天粪便出血明显。经肉苁蓉总苷干预后，DAI 评分逐渐降低，隐血情况逐渐降低。HZ 组体质量减轻率最低，粪便隐藏血量最低。结果表明肉苁蓉总苷改善了炎症性肠病引起的生理反应。

图6 肉苁蓉总苷对小鼠DAI 评分的影响Fig.6 Effect of Total glycosides of Cistanche deserticola on the IBD score in mice

3.5 肉苁蓉总苷下调IBD 小鼠脾脏中mTOR 和TGF-β 信号通路表达

mTOR 和TGF-β信号通路是激活炎症反应的两个重要信号通路。通过qRT-PCR 检测小鼠脾脏组织中mTOR 和TGF-β的表达，结果显示：DSS 对照组小鼠中mTOR 和TGF-β的mRNA 表达量较正常小鼠显著增加，与DSS 对照小鼠相比，肉苁蓉干预后小鼠中mTOR 和TGF-β表达显著降低。其中，高剂量组的下降幅度最为显著，且表达水平与正常组基本一致（图7）。结果表明，肉苁蓉总苷下调了mTOR 和TGF-β信号通路的表达。

图7 肉苁蓉总苷对小鼠脾脏中和mTOR 和TGF-β mRNA 表达水平的影响Fig.7 Total glycosides of Cistanche deserticola downregulates the mRNA of TGF-β and mTOR signaling pathways in IBD mice

3.6 PICRUSt2 功能注释分析

PICRUSt2 是一种基于生物16S rRNA 以及Greengene 数据库中的ASV tree 和ASV 的基因信息进行元基因组功能预测的生物信息工具。选用COG 数据库进行功能预测，结果显示，肠道菌群功能主要涉及RNA 加工；染色质结构和动力学；细胞周期控制、细胞分裂、染色体分割；防御机制；信号细胞壁/细胞膜/包膜生物发生；细胞外结构；细胞内运输、分泌和囊泡运输；能源生产和转换；碳水化合物的运输和代谢等20 多种功能。选取丰度排名前15 的功能及它们在每个样品中的丰度信息绘制热图（图8），并从不同功能层面进行聚类。与CZ 组相比，DZ 对照组小鼠的COG1132（ABCtype multidrug transport system）、COG0745（DNAbinding response regulator）、COG1131（ABC-type multidrug transport system）、COG1961（Site-specific DNA recombinase related to the DNA invertase Pin）、COG0438（Lycosyltransferase involved in cell wall bisynthesis）、COG0534（Na+-driven multidrug efflux pump）、COG0642（Signal transduction histidine kinase）、COG1595（DNA-directed RNA polymerase specialized sigma subunit）、COG0463（Endonuclease）、COG4974（Site-specific recombinase XerD）、COG2207（AraC-type DNAbinding domain and AraC-containing proteins）、COG1136（ABC-type lipoprotein export system）、COG1309（DNA-binding transcriptional regulator）功能基因表达异常。这些基因主要涉及：V：防御机制；T：信号转导机制；M：细胞壁/细胞膜/包膜生物生成；I：脂质运输和代谢；K：转录；L：复制、重组和修复。这六大功能给予肉苁蓉总苷后，这些有差异的生理功能表达均向正常组接近。与CZ 和DZ 组小鼠对比，HZ 组小鼠的COG1028（Short-chain alcohol dehydrogenase family）、COG0451（Nucleoside-diphosphate-sugar epimerase）基因发生高表达，这两个基因与I：脂质运输和代谢以及M：细胞壁/细胞膜/包膜生物生成功能有着密切联系，因此推测肉苁蓉总苷可能通过调节小鼠体内脂代谢、糖代谢过程及相关防御信号转导机制过程来调控IBD 小鼠损伤。

图8 PICRUSt2-功能丰度聚类热图Fig.8 Heatmap of the PICRUSt2-functional abundance clustering

4 讨论

IBD 会导致肠道黏膜的慢性炎症和溃疡，现代西方医学无法完全治愈，严重影响患者的生活质量[23-25]。中医认为，调整饮食可以平衡体内阴阳，有助于缓解肠道炎症[26]。中医饮食疗法在炎症性肠病的辅助治疗中可以发挥积极作用。肉苁蓉可作为辅助炎症性肠病治疗的传统保健食品原料。

网络药理学分析表明，肉苁蓉总苷成分对IBD 有防护作用的靶点254 个。GO 富集结果表明肉苁蓉总苷干预IBD 可能与信号传导、蛋白质磷酸化、凋亡过程负调控、蛋白质水解、先天免疫反应、细胞增殖的正向调节、细胞分化、DNA 模板的转录正调控、蛋白结合、ATP 结合、金属离子结合、锌离子结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、酶结合等生物过程及分子功能相关。活性成分-靶点-通路网络分析表明，肉苁蓉的活性成分可能通 过作用 于IL2、mTOR、ADH、CAS、SMAD、AMPK、NF-κB 等靶点来调控癌症通路、mTOR 通路、TGF-β 通路、JAK-STAT 通路、AMPK 通路等，进而影响细胞信号传导、增殖、分化、凋亡等。

根据网络药理学分析结果，选用DSS 诱导的IBD 小鼠模型模拟IBD 患者相似的临床症状，对分析结果进行验证。现有研究表明TGF-β 在整个IBD 疾病的形成和发生过程中居于中心，TGF-β1的大量表达，会导致结肠的上皮损伤与异常的修复，肌成纤维细胞增生及基膜下纤维化，最终造成IBD 的发生[27]。mTOR 作为一类重要蛋白质物质，是细胞生长和增殖的中心调节因子[28-29]。mTOR 参与调节许多重要的细胞过程，包括翻译、转录和自噬。其中，AMPK/mTOR 信号通路可以共同介导细胞内合成代谢和分解代谢过程[30-31]。此外，AMPK/mTOR 通路也被证实是调控IBD 疾病的重要通路[32]。mTOR 是AMPK 重要的下游信号分子，在自噬调控中起负调控作用，TGF-β1 也可以通过调节mTOR 相关信号通路表达水平抑制自噬，并可通过介导SMADS 的信号通路间接地对细胞起到调控作用[31，33]。本实验重点验证了mTOR 和TGF-β两个信号通路基因的表达。结果表明，肉苁蓉总苷能有效缓解患病小鼠体质量减轻及粪便出血，降低DAI 评分，抑制脾脏中mTOR 和TGF-β 信号通路表达。通过对小鼠粪便的16S rDNA 扩增子测序进行PICRUSt2 基因功能注释分析。结果表明，患病小鼠中 COG1132、COG0745、COG1131、COG1961、COG0438、COG0534、COG0642、COG1595、COG0463、COG4974、COG2207、COG1136、COG1309功能基因表达异常升高。给予肉苁蓉总苷干预后13 种基因表达恢复正常，同时COG1028、COG0451 基因高表达。推测肉苁蓉总苷可能通过调节小鼠体内脂代谢、糖代谢过程及相关防御信号转导等机制过程来缓解IBD 小鼠损伤。上述实验结果与网络药理学分析结果基本相同。

综上所述，肉苁蓉总苷通过多成分、多靶点、多途径协同作用治疗炎症性肠病。其作用靶点应该与IL2、mTOR、TGF-β、JAK-STAT、NF-κB 等相关，同时实验结果表明肉苁蓉总苷可能主要是通过抑制TGF-β、mTOR 两个信号通路表达来治疗炎症性肠病。本实验为阐明肉苁蓉治疗IBD 的临床应用提供了新的方法，然而，其具体机制及物质基础还需更深入的研究。