异柠檬酸脱氢酶-1 突变对胶质瘤血管生成的影响

阮建桥，王 晶，徐 辉，曹相玫

（1.宁夏医科大学，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院病理科，宁夏医科大学第一临床医学院，银川 750004）

胶质瘤是一种异质性疾病，在成人恶性原发性脑肿瘤中常见，占比为70%，由于具有极强的侵袭性，故预后不佳[1]。根据肿瘤的侵袭性生物学行为以及不良预后将其分为Ⅰ～Ⅳ级，可以为胶质瘤的治疗方案提供指导[2]。异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH） 是参与许多重要代谢过程的关键酶，包括IDH-1、IDH-2、IDH-3亚型，其中IDH-1 突变导致α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）转化为2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG），其作为癌代谢物是胶质瘤发生的关键驱动因素[3]。在胶质瘤中，绝大多数IDH-1 突变导致组氨酸替代精氨酸（IDH-1 R132H），IDH-1 突变先于其他分子改变，是胶质瘤发病的早期表现，也是成人胶质瘤的重要鉴别因素，具有预后价值和作为药物靶点的潜力[4-5]。现阶段关于IDH-1 突变对胶质瘤的迁移及侵袭尚不明确。血管生成与胶质瘤快速生长、转移及侵袭密切相关。本研究检测胶质瘤组织中血管生成因子与IDH-1 之间的关系，同时利用强力霉素诱导表达突变型IDH-1 的人胶质瘤U87 细胞，观察其迁移能力，探讨其可能机制，为临床治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

收集2020—2023 年宁夏医科大学总医院病理科胶质瘤病例198 例，男性112 例，女性86例；年龄≤20 岁者14 例，＞20～≤40 岁者50 例，＞40～≤60 岁者97 例，＞60 岁者37 例。肿瘤分级：Ⅰ级胶质瘤8 例，Ⅱ级胶质瘤56 例，Ⅲ级胶质瘤39 例，Ⅳ级胶质瘤95 例。肿瘤部位：额叶22 例，颞叶39 例，其他部位137 例。实验使用强力霉素（doxycycline）诱导表达mutIDH-1（含IDH-1 R132H）的人脑胶质瘤细胞（U87 细胞）由空军军医大学叶菁教授馈赠，生长方式为贴壁生长，培养基为含1%双抗、10%血清的最低必需培养基（MEM）。

1.2 实验试剂

doxycycline 诱导表达体系：1） 含IDH -1 R132H 的慢病毒表达载体为Plvx -IDH -1（R132H）；2）Tet -On 慢病毒表达载体为Plvx -Tet-On；3）doxycycline 诱导剂量为10 μg·μL-1。MEM 购于上海帝博思生物科技有限公司，LumiBest 卓越型电化学发光液（SB-WB011）购自上海圣尔生物科技有限公司，胎牛血清购于上海素尔生物科技有限公司，全蛋白提取试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，IDH-1 一抗试剂（均为鼠单抗）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、血管内皮生长因子（VEGF）、CD34、Ki-67，通用型二抗、EDTA （pH 9.0） 修复液、DAB 显色液、PBS均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；VEGFR-2 抗试剂（兔单抗）购于Bioworld Technology公司；抗体稀释液购自上海威奥生物科技有限公司；苏木素购自北京九州柏林生物科技有限公司；PAS 试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.3 免疫组化法（immunohistochemistry，IHC）

胶质瘤组织常规石蜡切片3～4 μm，65 ℃烤片过夜，切片脱蜡至水，EDTA（pH 9.0）高压修复3 min，自然冷却，3% H2O2水溶液阻断内源性过氧化物酶8 min，PBS 溶液冲洗，加入一抗IDH-1、GFAP、Ki-67、VEGF（稀释比例1∶400）、VEGFR-2（稀释比例1∶250）、CD34（稀释比例1∶200），37 ℃恒温箱孵育70 min，PBS 溶液冲洗，加入二抗，37 ℃恒温箱孵育30 min，PBS 溶液冲洗，DAB 显色10 min，流水冲洗阻断显色，苏木素滴染1 min，水洗，1%盐酸乙醇分化3 s，水洗，淡氨水返蓝数秒，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 PAS、CD34 双重染色

CD34 进行1.3 中的IHC 检测步骤至DAB显色，水洗，加入过碘酸氧化5～10 min；流水冲洗5～10 min；滴加雪夫试剂10～15 min；流水冲洗10～15 min；苏木素复染1 min，水洗，1%盐酸乙醇分化3 s，流水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，脱色中性树胶封片。

1.5 胶质瘤组织IHC 及特殊染色结果判读标准

1）IDH-1、VEGF、VEGFR-2 在细胞质有棕黄色产物形成时判读为阳性，细胞质无显色则为阴性；CD34、GFAP 在细胞膜有棕黄色产物时判读为阳性，细胞膜无显色则为阴性，均采用半定量法进行判读。每张切片随机选取5 个高倍镜（×400）视野，每个视野计数细胞100 个，首先计算阳性染色细胞数占总细胞数的比例，无阳性染色细胞为0 分，阳性细胞数≤10%为1 分，阳性细胞数11%～50%为2 分，阳性细胞数51%～75%为3 分，阳性细胞数＞75%为4 分。同时评判染色深浅，无色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分，染色强度依据背景着色进行对比。根据两项计分相加所得总分进行结果判定。0～2 分为阴性（-），3～4 分为弱阳性（+或++），＞4分为强阳性（+++）[6]，阳性率=（强阳性例数÷总例数）×100%。2）Ki-67 指数代表肿瘤细胞的增殖活性，指数≤10%判读为低表达，指数＞10%判读为高表达[7]。3）CD34 染色检测胶质瘤中的内皮细胞，PAS 染色检测肿瘤血管的基底膜。CD34 染色表达于内皮细胞，呈棕黄色；PAS 标记血管基底膜，管腔基底膜呈玫红色。高倍镜下CD34 阴性、PAS 阳性管道样结构，即为血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）[8]。

1.6 细胞培养及doxycycline 诱导

用含1%双抗、10%血清的MEM 培养液进行U87 细胞培养。细胞隔天换液。将培养瓶中生长至90%密度的胶质瘤U87 细胞消化、计数，在直径10 cm 的细胞培养皿中接种1×106个细胞。接种8 h 后待细胞贴壁。实验分组为doxycycline 诱导表达组（dox+组）和非doxycycline 诱导表达组（dox-组），dox+组为完全培养基含doxycycline（10 μg·μL-1）培养；dox-组为完全培养基培养。培养48 h 后取出至显微镜下观察诱导效率。

1.7 Western blot 检测U87 细胞内IDH-1、VEGF、VEGFR-2 的表达

U87 细胞诱导48 h 后，收集细胞沉淀提取全蛋白。配制SDS-PAGE 凝胶，上样等量蛋白进行电泳，湿转蛋白至PVDF 膜上。10%脱脂牛奶室温封闭1.5 h 后用抗体稀释液稀释一抗（VEGF 1∶400、VEGFR-2 1∶250）4 ℃孵育过夜。二抗（1∶2 000）室温孵育1.5 h，化学发光试剂显色1 min 后曝光并进行灰度测量[9]。

1.8 细胞划痕实验检测U87 细胞迁移能力

六孔板背面画“十”字，每孔加入约5×105个细胞，每组设置2 个复孔，重复进行3 次。过夜后细胞贴壁且密度达到80%～90%，用200 μL 枪头在六孔板背后的“十”字进行画线。用PBS 冲洗划起的细胞，在同一区域记录采集0、24 和48 h 的划痕范围照片[10]。用Image J 软件测量划痕区域的面积，分析细胞的迁移速度，采用细胞划痕愈合率比较细胞的迁移能力。细胞划痕愈合率=［（0 h划痕面积-观察时间点划痕面积）÷0 h 划痕面积］×100%。

1.9 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，计数资料用例表示，两组间比较采用卡方检验；计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 法，各独立实验均重复3 次。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IDH-1 突变胶质瘤患者临床病理特征

胶质瘤组织IDH-1 蛋白阳性表达与年龄、性别、部位及组织分级均无相关性（P＞0.05）；Ki-67 增殖指数与患者性别及病理分级存在关联：高表达在男性患者中表达率高（P＜0.05），低表达在女性患者中多见（P＜0.05），高表达在高级别胶质瘤（Ⅲ、Ⅳ级）中表达率高于低级别胶质瘤（Ⅰ、Ⅱ级）；GFAP 在低级别胶质瘤（Ⅰ、Ⅱ级）中阳性率为36.53%（61/167），在高级别胶质瘤（Ⅲ、Ⅳ级）中阳性率为63.47%（106/167），在低级别胶质瘤中阳性率低于高级别胶质瘤（P＜0.05），见表1。

表1 胶质瘤组织IDH-1、Ki-67 及GFAP 表达与患者临床病理特征的关系（例）

2.2 胶质瘤组织HE 染色结果

经HE 染色后确定分级，Ⅰ级胶质瘤8 例，Ⅱ级胶质瘤56 例，Ⅲ级胶质瘤39 例，Ⅳ级胶质瘤95 例，其中以Ⅱ、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤常见，见图1。

图1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤HE 染色（×200）

2.3 胶质瘤组织中IDH-1 与Ki-67、GFAP 的关系

胶质瘤组织IHC 结果显示，Ki-67 高表达在突变型胶质瘤中表达率为56.86%（58/102），野生型胶质瘤中为57.29%（55/96）。Ki-67 高表达、低表达在突变型和野生型胶质瘤中差异无统计学意义（P＞0.05）；GFAP 在突变型胶质瘤中阳性表达率为92.16%（94/102），野生型中为76.04%（73/96），与野生型相比，GFAP 在突变型中高表达（P＜0.05），见表2、图2。

图2 胶质瘤组织IDH-1、Ki-67、GFAP 的表达（×200）

表2 胶质瘤组织Ki-67、GFAP 表达与IDH-1 突变的关系（例）

2.4 胶质瘤组织中CD34、VEGF 与VEGFR-2 的表达

在IDH-1 突变型中，VEGF 阳性表达率为70.59%（72/102），VEGFR-2 为73.63%（75/102），CD34 为68.63%（70/102）；在IDH-1 野生型中，VEGF 阳性表达率为54.17%（52/96），VEGFR-2为59.38%（57/96），CD34 为51.04%（49/96）；VEGF、VEGFR-2、CD34 在IDH-1 突变型中的表达均高于IDH-1 野生型（P 均＜0.05），见图3。

图3 胶质瘤组织中VEGF 与VEGFR-2、CD34 的表达（IHC×200）

2.5 IDH-1 突变胶质瘤的VM

PAS-CD34 双染胶质瘤组织显示，血管内壁CD34 染色呈阳性，基底膜呈玫红色，为肿瘤血管成分（VM 阴性）；由胶质瘤细胞形成的不规则管腔样结构，CD34 染色呈阴性，基底膜不完整，PAS 呈阳性管道样结构（VM 阳性）。VM 在突变型以及野生型中均有表达，见图4。

图4 PAS-CD34 双染检测胶质瘤组织中的VM 形成（×400）

2.6 IDH-1 突变改变U87 细胞中VEGF、VEGFR-2 蛋白的表达水平

Western blot 检测结果显示，与dox-组相比，dox+组的VEGF、VEGFR-2 蛋白表达均增高，与IHC 结果一致（P 均＜0.05），见图5。

图5 Western blot 检测dox-组和dox+组U87 细胞IDH-1、VEGF、VEGFR-2 相对蛋白的表达水平

2.7 IDH-1 突变对U87 细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果显示，在24、48 h 中dox+组的细胞划痕愈合率均高于dox-组（P 均＜0.05），见图6。

图6 细胞划痕实验检测IDH-1 突变对U87 细胞迁移能力的影响

3 讨论

胶质瘤是颅内最常见恶性肿瘤之一，由中枢神经系统中的胶质细胞/胶质祖细胞发展而来[11]，最大程度手术安全切除、放疗、化疗、免疫疗法以及相关联合治疗可以提高胶质瘤患者的预后，但是胶质瘤的极高致死率、预后效果不佳、复发率高是患者生存率极低的主要因素[12]。IDH-1 突变在Ⅱ级、Ⅲ级胶质瘤中常见，90%发生在Ⅱ级胶质瘤中，60%发生在Ⅲ级胶质瘤中，同时在继发性胶质瘤中也很常见[13]。有研究[14]报道，IDH-1 突变会导致2HG 堆积过多并抑制多种酶的功能以及多种依赖于α-KG 的染色质重塑酶，从而影响肿瘤代谢循环过程。在本实验中发现，IDH-1 突变与患者年龄、性别、发病部位、病理级别均无关联。细胞划痕实验中，dox+组的U87 细胞在24、48 h划痕面积高于dox-组，证实IDH-1 突变使细胞的迁移能力增强，从而增加肿瘤的迁移。Ki-67 是一种仅在细胞周期G1、S、G2 或M 期中期的细胞表达核心抗原，正常脑组织中几乎不表达，Ki-67标记指数10%是区分低级别和高级别胶质瘤的临界点，对预测患者的生存具有重要意义[15]。本研究结果显示，Ki-67 高表达在男性患者中表达率高，低表达在女性患者中多见，在高级别胶质瘤（Ⅲ、Ⅳ级）中表达率高，在突变型和野生型胶质瘤中表达差异无统计学意义，这一结果与肿瘤级别越高，恶性程度越高、侵袭性越强一致。GFAP 是胶质瘤标志性的一种中间丝蛋白，几乎只在星形细胞胶质瘤中表达，易受细胞环境的影响，与肿瘤的迁移息息相关[16]。本实验发现，GFAP在突变型中高表达，在高级别胶质瘤中表达增高，这与Priambada 等[17]关于少突胶质细胞分化和IDH-1 野生型弥漫性星形细胞瘤中GFAP 表达降低的研究结果一致，考虑GFAP 与胶质瘤的侵袭性及预后有关。

在许多恶性肿瘤的治疗方案中，抗血管治疗至关重要。VEGF 是参与血管生成的重要因子，胶质瘤细胞在缺氧情况下，VEGF 与其受体VEGFR-2 的下游信号通路被缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）激活，同时血管内皮细胞增殖、迁移，由肿瘤细胞形成不规则管状结构，形成新生血管[18]。本实验发现，VEGF、VEGFR-2、CD34 在突变型中高表达，同时Western blot 检测显示，dox+组中VEGF、VEGFR-2 表达升高，两项结果提示IDH-1 发生突变，降低HIF-1α 表达水平，使VEGF 过表达，促进新生血管生成，VEGF 过表达与胶质瘤预后不良相关[19]，因此，临床通过抗VEGF 治疗增加无进展生存期并改善胶质瘤患者的生活质量。VM 在肿瘤血管形成中具有很高的可塑性，在微血管密度较低的胶质瘤区域大量存在，完成肿瘤生长过程中的血氧供应[20]。在双染实验中，CD34 染色阴性、PAS染色阳性的胶质瘤细胞形成的管状结构，即VM阳性。VM 在突变型及野生型中均表达，证实胶质瘤通过血管生成，促进肿瘤转移、侵袭。VM 在高级别胶质瘤中高表达，更易形成微血管，使胶质瘤细胞逃脱缺氧的环境及坏死区域，具有较强的侵袭性，导致患者的治疗效果及预后均不佳[21]。

本实验通过组织及细胞水平探讨IDH-1 突变与胶质瘤血管生成的关系，进一步证实IDH-1突变在胶质瘤中具有至关重要的作用，一种是IDH-1 突变，2HG 大量堆积，抑制HIF-1α，诱导VEGF 表达，促进血管生成，增强胶质瘤侵袭及转移能力[22]；另一种是IDH-1 突变过表达可以减少胶质瘤细胞增殖，使发生IDH-1 突变的胶质瘤患者预后更好[23]。本实验通过了解血管生成的机制及其抑制在胶质瘤治疗中的意义，为今后临床胶质瘤的抗血管治疗提供新的理论依据。