NF-κB/P65 在食管鳞癌细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中表达的临床病理意义

王瑞肖，潘小丽，张宁妹，陈晓珍，江海峰，黄凌燕

（宁夏医科大学总医院病理科，宁夏医科大学第一临床医学院，银川 750004）

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，2020 年我国新发食管癌病例32.4 万，死亡病例30.1 万[1]。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC） 是食管癌最常见的组织学类型，由于其发病隐匿，发现时多为进展期，5 年生存率不到25%[2]。ESCC 的侵袭性与癌细胞增殖、转移、去分化、上皮间质转化等多个生物学功能密切相关。另外，肿瘤微环境，尤其是肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）对癌症作用已引起学者们的广泛关注，TILs 对癌症存在双向作用，一方面免疫细胞具有杀伤癌细胞的功能，另一方面肿瘤细胞对免疫细胞具有免疫逃逸的能力[3]，可能增强ESCC 的侵袭能力。在癌细胞和TILs 中共同表达的作用因子分别通过哪些生物学功能影响ESCC 的侵袭能力有待研究，NF-κB/P65 是NF-κB 家族的经典成员之一，在癌细胞和TILs 中均有表达，但其分别在ESCC 和TILs 中的表达对于ESCC 发病机制和预后方面的研究还不清楚，因此，本研究探讨NF-κB/P65 分别在ESCC 癌细胞和TILs 中的表达对患者预后的意义。

1 资料与方法

1.1 资料收集

回顾性分析宁夏医科大学总医院2007—2012 年的ESCC 患者基本临床病理资料80 例，包括性别、年龄、癌症大小、分化程度、淋巴结转移情况等。1）纳入标准：所有患者术前均未接受放化疗，病理诊断类型为ESCC，病理分期1～3期，均行R0 根治性切除。2）排除标准：临床病理及随访资料不完整，术后生存时间小于3 个月，远处转移。病理诊断标准参照世界卫生组织（WHO）第五版，肿瘤临床分期参照美国癌症联合会（AJCC）第八版[4]。

1.2 免疫组化法检测ESCC 中NF-κB/P65 表达

收集ESCC 组织及周围正常食管组织，10%中性缓冲甲醛固定24 h，石蜡包埋切片，HE 染色。免疫组化切片用EDTA（pH=8.0）煮沸5 min，过氧化氢封闭10 min，加入NF-κB/P65 一抗（1∶100，D14E12，美国CST 公司）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min，DAB 显色。NF-κB/P65 阳性染色在细胞核和（或）细胞质中。阳性对照为抗体公司赠送的阳性切片，阴性对照为PBS 代替一抗。免疫组化染色结果由两位高年资病理医师进行显微镜下判读。1）有丝分裂象计数：在高倍显微镜下，观察NF-κB/P65 在癌细胞、正常上皮细胞、TILs 中的阳性表达率。计算10 个高倍镜的阳性表达率并取平均值。在高倍镜下计数癌细胞有丝分裂象，随机选取10 个高倍镜下计数并计算总和。2）TILs 判读：在ESCC 癌内和癌周均可见TILs，癌内TILs 是计算间质中淋巴细胞占间质的百分比；对于癌周TILs 则计算癌周1 mm 内间质中的淋巴细胞所占百分比，随机选取10 个高倍镜计算后，取平均值。

1.3 生物信息分析

癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库涵盖ESCC（n=82）和正常者（n=145）。利用TCGA 数据库分析NF-κB/P65 在人ESCC 中的表达水平。利用TCGA 数据集分析NF-κB/P65 的RNA 测序表达作用。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 23.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准误（Mean±SEM）表示。两组比较采用Mann-Whitney U 检验，3 组及以上组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），相关性采用pearson 相关分析，患者预后采用Kaplan Meier 生存分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

回顾性收集80 例食管鳞癌病例，男性65例，女性15 例；年龄41～72 岁，中位年龄57 岁。年龄＜60 岁者ESCC 癌细胞中NF-κB/P65 表达的阳性率比年龄≥60 岁者高（P＜0.05）；不同年龄组间在性别、血型、饮酒史、吸烟史、基础疾病、肿瘤位置方面差异均无统计学意义（P 均＞0.05），见表1。

表1 ESCC 癌细胞中NF-κB/P65 阳性表达率临床特征的关系

2.2 ESCC 中NF-κB/P65 的阳性率表达情况

免疫组化检测结果显示，NF-κB/P65 在周围正常鳞状上皮中少量弱表达，在原位鳞癌和浸润性鳞癌中弥漫强阳性表达，在正常鳞状上皮中NF-κB/P65 阳性表达率［（11.59±2.56）%］均低于原位鳞癌［（81.79±2.57）%］和浸润性鳞癌［（84.14±1.77）%］（P＜0.05），见图1。

图1 NF-κB/P65 在ESCC 细胞中的表达情况

2.3 癌细胞中NF-κB/P65 高表达可能促进ESCC 进展

ESCC 进展与癌组织分化程度、临床分期、淋巴结转移、细胞分裂等因素相关。鳞状细胞癌从分化程度而言，非角化型鳞癌比角化型鳞癌分化更差，NF-κB/P65 在非角化型鳞癌中的阳性表达率为（86.68±1.78）%，而角化型鳞癌为（75.63±14.28）%，非角化型鳞癌高于非角化型鳞癌（P＜0.05），见图2A～图2C，NF-κB/P65 阳性表达率升高与ESCC 分化更差有关。NF-κB/P65 在ESCC中的表达与核分裂象呈正相关（r=0.26，P=0.022），见图2D。NF-κB/P65 阳性表达率在临床分期、淋巴结转移与否之间差异无统计学意义（P＞0.05），与癌灶大小、淋巴结转移数目均无相关性（P 均＞0.05）。

2.4 癌细胞中NF-κB/P65 高表达患者预后差

随访80 例ESCC 患者，总生存期为4～162个月，按照癌细胞内NF -κB/P65 阳性表达率＜80%和≥80%分为NF-κB/P65 高表达组和低表达组，NF-κB/P65 高表达组生存期为4～162 个月，中位生存期为（65.00±17.40）个月，平均生存期为（68.39±6.44）个月；NF-κB/P65 低表达组生存期为8～156 月，中位生存期为（106.00±8.39）个月，平均生存期为（102.451±10.23）个月，癌细胞NF-κB/P65 高表达组生存期短于NF-κB/P65 低表达组（P＜0.05），见图3。

图3 ESCC 癌细胞中NF-κB/P65 的表达情况

2.5 肿瘤内TILs 在ESCC 中的作用

ESCC 癌内间质中TILs 的表达量，最低为5%，最高为80%，平均为32.96%。癌内间质中TILs 的表达量在临床1 期（42.78±4.41）时最高，高于临床2 期（30±2.74）、3 期（31.3±3.15），（P均＜0.05）。另外，ESCC 间质中TILs的量与癌灶大小呈负相关（r=0.24，P=0.036），说明随着癌灶体积的增大，癌组织内间质中TILs 的量变少。ESCC 中，TILs 在正常鳞状上皮和ESCC、角化型和非角化型鳞癌、有无淋巴结转移之间差异均无统计学意义（P 均＞0.05），与有丝分裂数无相关性（P＞0.05），与患者生存期的长短差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图4 肿瘤内TILs 在ESCC 中的作用

2.6 ESCC 中NF-κB/P65 在TILs 中表达的作用

分析P65 在癌内和癌周TILs 中的表达对ESCC 侵袭能力的影响和患者预后的意义。免疫组化结果显示，癌内TILs 中NF-κB/P65 的阳性表达率与癌内TILs 的量呈正相关（r=0.55，P＜0.001），癌内TILs 的量越多，癌内TILs 中NF-κB/P65 的阳性表达率越高。按照NF-κB/P65 在癌内TILs的阳性表达率＜30%和≥30%分为低表达组和高表达组，结果显示，高表达组患者预后高于低表达组（χ2=4.293，P=0.038），说明NF-κB/P65 在癌内TILs 中阳性表达率越高，患者生存期越长。对于癌周TILs 中NF-κB/P65 的表达，结果显示，癌周TILs 的量与癌周TILs 中NF-κB/P65 的阳性表达率呈正相关（r=0.316，P＜0.05），表明癌周TILs的量越多，癌周TILs 中NF-κB/P65 的阳性表达率越高。检测NF-κB/P65 在癌内和癌周TILs 表达的差异性，结果显示，NF-κB/P65 在癌周TILs的阳性率为（52.09±2.71）%，癌内TILs 的阳性率为（34.88±2.61）%，癌周TILs 的阳性率高于癌内TILs 的阳性率（P＜0.001）。另外，NF-κB/P65 在浸润性癌TILs 的阳性率为（51.20±2.77）%，原位癌为（70.00±2.36）%，浸润性癌TILs 的阳性率低于在原位癌TILs 的阳性率（P=0.009 1）。生存分析结果显示，将NF-κB/P65在癌周TILs 阳性表达率＜30%和≥30%分为低表达组和高表达组，高表达组存活率高于低表达组（χ2=7.064，P=0.008），见图5。

图5 ESCC 中NF-κB/P65 在TILs 表达的作用

2.7 生物信息分析ESCC 中NF-κB/P65 的功能

通过TCGA 数据库对NF-κB/P65 与癌症的形成和进展，以及对TILs 相关因子进行功能分析，结果显示，ESCC 中NF-κB/P65 表达与DNA修复、上皮间质转化、基质形成呈正相关（P＜0.05），与炎性反应和IL-10 信号通路均呈正相关（P＜0.05），与T 淋巴细胞表达呈负相关（P＜0.05），见图6。

图6 ESCC 中NF-κB/P65 功能分析

3 讨论

NF-κB/P65 作为一个经典的炎症因子可以诱导细胞增殖[5]。与结肠炎相关癌症和肝炎相关癌症小鼠模型均表明NF-κB/P65 可能通过TILs促进癌症的发生[6-7]。

本研究检测NF-κB/P65 在ESCC 细胞中的表达情况，结果显示，NF-κB/P65 在原位鳞癌和浸润性鳞癌中的表达均高于正常鳞状上皮细胞，表明NF-κB/P65 可能参与了ESCC 的发生。就癌组织分化程度而言，NF-κB/P65 在非角化型鳞癌细胞中的表达高于角化型鳞癌，表明NF-κB/P65可能参与了ESCC 去分化。癌细胞NF-κB/P65 阳性表达率与有丝分裂象数量呈正相关，说明NFκB/P65 促进了ESCC 细胞分裂与增殖，导致癌细胞生长加快，有研究[8]表明，NF-κB/P65 可能通过ADAM17 的持续激活导致ESCC 细胞活力增强、凋亡减少。Shi 等[9]的研究也显示P65 可促进ESCC的增殖。癌细胞中NF-κB/P65 高表达患者的生存率明显比低表达的低，这些结果说明，NF-κB/P65可能通过促进癌细胞去分化和增殖来促进ESCC进展，导致患者生存性差[10]。生物信息学分析结果也表明，NF-κB/P65 可能通过与DNA 修复、上皮间质转化及肿瘤基质的作用促进ESCC 的发生和进展。Han 等[11]的研究也表明NF-κB/P65 作为ESCC 中重要的信号通路，可以通过对SFE 的作用抑制ESCC 的进展。

ESCC 中，癌内TILs 的百分比在临床1 期患者中明显高于临床2、3 期患者，且与癌灶大小呈负相关，说明在ESCC 初期招募TILs 使其数量增多，随着临床分期的增高、癌灶增大，TILs 的量逐渐减少，但是TILs 量的多少与患者预后长短差异无统计学意义，与Jiang 等[12]和Sudo 等[13]的研究结果相似。本研究结果表明，ESCC 中癌内和癌周中NF-κB/P65 在TILs 的表达均与TILs 的量呈正相关，TILs 所占间质百分比越高，其内NFκB/P65 表达的阳性率越高，Millen 等[14]在结直肠癌和Vecchio 等[15]在恶性黑色素瘤中的研究结果均与本研究一致。另外，NF-κB/P65 在癌周TILs的阳性表达率高于癌内TILs，且癌周TILs 中NF-κB/P65 的阳性表达率在原位癌高于浸润性癌，生存分析结果显示，癌内和癌周TILs 中NFκB/P65 阳性表达率越高，患者预后越好。这些结果表明，NF-κB/P65 在TILs 中的作用对ESCC 进展具有一定的抑制作用，癌周TILs 中NF-κB/P65 的作用比癌内TILs 中更强，随着从原位鳞癌向浸润性鳞癌进展，癌周TILs 中，NF-κB/P65 对ESCC 的保护作用逐渐变弱。通过生物信息分析，NF-κB/P65 在ESCC 中TILs 的表达可能通过与炎性反应、T 淋巴细胞和IL-10 抗炎症信号通路的作用，对ESCC 进展具有抑制作用。Zhang 等[16]的研究表明，在结肠癌中，Agpat4/LPA 通过巨噬细胞对NF-κB/P65 的作用调节抗肿瘤反应。

ESCC 中NF-κB/P65 的作用复杂，其在癌细胞和TILs 中表达可能通过不同的下游作用因子发挥作用，对ESCC 进展和患者预后的影响也具有明显差异性。NF-κB/P65 在ESCC 细胞中高表达，对ESCC 的发生和侵袭能力增强可能具有促进作用，NF-κB/P65 阳性率越高，患者预后越差，相关的研究表明，TNF-α 刺激NF-κB/P65 通路上调SLC52A3 的转录，导致癌细胞增殖和集落能力增强，最终使患者预后差[17]。TILs 在ESCC 初期作用更强，随着ESCC 进展，癌灶越大，TILs 作用越小。ESCC 中TILs 的量越多，NF-κB/P65 阳性表达率也越高，且癌周TILs 中NF-κB/P65 阳性表达率更明显，NF-κB/P65 在癌内和癌周TILs中表达越高，患者预后越好。NF-κB/P65 在TILs的表达可能对ESCC 具有一定抑制作用，相似的研究表明，PD-1/PD-L1 信号通过NF-κB/P65 上调淋巴上皮中VCAM-1 的表达，阻断高度脆弱的Treg 和Teffs 向引流淋巴结的肿瘤出口，促进肿瘤消退[18]。总之，NF-κB/P65 在ESCC 细胞中呈现癌基因的潜在功能比较明显，但其在TILs 中的作用可能是机体免疫能力的反映，对ESCC 的进展和预后具有保护作用，其具体的作用机制尚需广泛深入研究。