耐盐浮萍品种筛选及耐盐机制研究

刘军,贺瑞梅,李宗皓,黄振果,周功克,4,刘宇,4

(1.青岛农业大学园林与林学院,山东青岛 266109;2.博兴县纯化镇人民政府,山东滨州 256507;3.青岛农业大学资源与环境学院,山东青岛 266109;4.东营青农大盐碱地高效农业技术产业研究院,山东东营 257000)

盐碱地是盐类集积的一种土地类型,据不完全统计,我国有9 913万hm2的盐碱地,主要集中分布在西北、东北、华北及东部滨海地区,占全国可利用土地面积的4.88%[1]。近20年来,由于森林砍伐、工业污染和肥料的过量使用等问题引起土壤次生盐渍化,造成盐碱化的土地面积逐年增加。土壤盐碱化严重威胁我国耕地面积和粮食安全,因此选育耐盐植物资源迫在眉睫。

较高的盐分会导致植物产生渗透胁迫、离子毒害、氧化胁迫等次级胁迫[2]。盐胁迫下产生的活性氧物质包括超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢等,可以通过攻击植物细胞的蛋白质、脂质、核酸等大分子物质,进而抑制植物的光合作用和生长发育,甚至导致植物死亡。有研究表明,不同浓度NaCl胁迫处理中药材半夏,随着NaCl浓度的增加,半夏各部位的脯氨酸含量和丙二醛含量呈上升趋势,抗氧化酶活性为先增加后降低[3];土壤中Na+浓度小于2 g/L时有利于海滨锦葵的生长和发育,因此,钠离子是海滨锦葵生长所需的有益元素[4];在低浓度NaCl(50 mmol/L)胁迫下,甜高粱植株体内脯氨酸含量没有显著变化,而在中高浓度NaCl(>100 mmol/L)胁迫下脯氨酸含量显著增加[5]。由此可见,不同植物对不同浓度NaCl胁迫的反应策略并不相同。

浮萍是一种单子叶水生植物,生长在水田、池塘、湖泊等静水水体表面,分布较广泛,在我国南北省份均有分布[6]。浮萍将是一种非常具有潜力的淀粉和蛋白类资源植物,其优势在于:(1)浮萍是生长速度最快的植物之一,以类似酵母的出芽生殖方式繁衍后代,其繁殖率几乎接近指数增长;(2)淀粉含量极高,经过逆境诱导后可以达到干重的65%;(3)蛋白质含量高且氨基酸种类齐全,可作为高品质蛋白质的来源;(4)具有较强的抗逆性,可适应盐碱地复杂的生态环境[7];(5)结构简单,只有类似叶片的叶状体结构,可通过叶状体直接吸收水体中的无机和有机化合物。崔姜伟等[8]研究表明浮萍可高效吸收富营养化水体中的N、P等营养,避免水体出现水华现象。此外,浮萍在适应逆境过程中能积累大量淀粉和高品质蛋白质,可以作为淀粉和蛋白质原料来源[7],因此浮萍具有非常广阔的开发利用前景。

为了筛选适合东营盐碱地水资源生长的耐盐浮萍资源,本研究利用200 mmol/L NaCl处理浮萍种质资源,通过表型观察及色素变化等方法初步判定水生植物浮萍抗盐能力,进一步通过生理指标检测探讨浮萍的耐盐机制,以期筛选高耐盐浮萍品种资源。此外,利用浮萍具有高效合成淀粉的特性,本研究所获得的耐盐浮萍将在构建东营盐碱地的“水上粮仓”中发挥重要作用,以期为我国粮食短缺寻找一条新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取12个浮萍品种(‘Spirodela 4019’‘Landoltia 5001’‘Landoltia 5009’‘Lemna 6008’‘Lemna 6014’‘Lemna 6101’‘Lemna 6109’‘Lemna 6114’‘Lemna 6202’‘Lemna 6203’‘Lemna 6204’‘Lemna 6205’,为了便于表述,后文使用相应品种中的数字代替品种名)继代于SH液体培养基上,于标准植物培养间复苏10 d,然后将健康的浮萍继代于新鲜SH液体培养基,培养5 d至足够生物量。本研究使用与东营盐碱水渗透势相似的200 mmol/L NaCl溶液筛选浮萍种质资源库。对照组为SH液体培养基,在SH液体培养基中添加200 mmol/L NaCl作为处理组,将浮萍种植于对照和处理的SH培养基中培养3 d(浮萍2～3 d繁殖一代),可用于各项生理指标测定和表型分析。植物培养间参数设置如下:温度为(25±1)℃,光强为110 μmol·m-2·s-1,光周期为16 h/8 h(光期/暗期)。

1.2 生理指标的测定

叶绿素含量的测定参照Liu等[9]的试验方法。将浮萍鲜样置于低温冷冻干燥器中处理20 h,使用十万分之一天平称量6 mg浮萍干样于2 mL离心管中,加入2 mL 96%乙醇,黑暗处抽提36 h。离心取上清液,使用酶标仪(Tecan,瑞士)测定吸光值,波长设置为665 nm、649 nm、470 nm。

电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量测定及抗氧化酶(CAT、POD)活性测定均参考Liu等[10]的方法进行。

1.3 数据统计分析

使用Excel 2019进行数据整理和计算;使用DPS进行显著性检验;使用SigmaPlot 12.5进行数据作图。数据为至少3个生物重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 耐盐浮萍品种资源初步筛选

浮萍用200 mmol/L NaCl溶液胁迫3 d后(至少繁殖一代)观察叶状体表型变化(见图1)发现,与对照组相比较,浮萍品种5001、6114、5009、6109、6205表现出明显的叶片黄化和根系变短等表型;6008、6014、4019叶状体则出现明显白化和生长点枯死现象。相反,6203、6202、6101、6204品种则生长状态良好,叶片呈深绿色。此外,在盐胁迫处理过程中,还发现浮萍的叶状体之间不会出现散落和数目减少的现象,多数浮萍的褪绿表现是从老叶开始,逐步扩展到生长点位置,而6008、6014和4019品种则是从生长点开始失绿甚至死亡,表现出盐敏感性。通常情况下,正常生长的浮萍叶状体呈现凸起状,俯视角度叶面积可能会稍小一些,而盐敏感品种6014和6008的叶状体则表现出黄化甚至死亡,此时叶状体呈扁平松弛状态,叶状体凸起消失,导致叶片俯视角度看起来可能略大一点。

图1 NaCl胁迫处理浮萍叶状体表型观察

2.2 NaCl胁迫处理后叶绿素a和b含量变化

在NaCl胁迫处理下,各品种浮萍的叶色均呈现不同程度的变化,因此检测了叶绿素a、b的含量。结果如图2A显示,叶绿素a含量下降最少的两个品种为6204和6101,分别下降了56.99%和56.46%,同时叶绿素b含量下降最少。而叶绿素a含量下降最多的两个品种为6014和6008,分别下降了83.83%和86.91%,同时叶绿素b含量下降最多(图2B)。以上检测的四个品种叶绿素a和叶绿素b含量与图1直接观察的表型一致,因此将6204和6101作为耐盐品种,6014和6008作为盐敏感品种,并作为后续试验材料。

图2 NaCl胁迫处理对浮萍叶绿素a(A)和叶绿素b(B)含量的影响

2.3 NaCl胁迫处理后细胞损伤度的变化

当植物遭受盐胁迫时,会造成细胞质离子渗透,表现为离子渗透率明显增加[11-12]。如图3A所示,盐胁迫3 d后,四个浮萍品种的离子渗透率均显著增加,但两个盐敏感品种增加幅度明显高于两个耐盐品种。另外,两个盐敏感品种6014和6008的细胞膜严重破坏,细胞损伤度分别高达90.78%和91.14%;而两个耐盐品种6204和6101的细胞膜损伤度分别为56.21%和48.11%(图3B),耐盐浮萍品种的细胞损伤度显著低于盐敏感品种,且6204的损伤度显著低于6101。

图3 NaCl胁迫处理对浮萍离子渗透率(A)和细胞损伤度(B)的影响

2.4 NaCl胁迫处理后丙二醛含量的变化

盐胁迫产生的活性氧会攻击细胞膜,造成膜脂过氧化程度加重,表现为膜脂过氧化产物丙二醛的大量积累[11]。如图4所示,当NaCl胁迫处理后,不同品种浮萍体内的丙二醛均大量积累。与对照组相比较,盐敏感品种6014和6008丙二醛含量分别显著增加了139.88%和323.43%,而耐盐品种6204和6101的丙二醛含量有所增加,但没有显著的差异。由此可见,耐盐浮萍品种膜脂过氧化程度显著小于盐敏感品种,表明耐盐浮萍品种能够较好地适应高盐胁迫。

图4 NaCl胁迫处理对浮萍丙二醛含量的影响

2.5 NaCl胁迫处理后脯氨酸含量的变化

植物在盐胁迫下会积累大量次生代谢物质以抵御渗透胁迫,其中脯氨酸就是植物体内一类重要的渗透调节物质[12]。与对照组相比,盐敏感品种脯氨酸含量没有显著变化,而耐盐品种6204和6101体内脯氨酸含量则显著增加,分别增加了104.67%和506.11%(图5)。以上结果表明:在200 mmol/L NaCl胁迫下,耐盐浮萍品种6204和6101通过积累大量脯氨酸以增强渗透调节能力。

图5 NaCl胁迫处理对浮萍脯氨酸含量的影响

2.6 NaCl胁迫处理后过氧化氢酶和过氧化物酶活性的变化

抗氧化酶具有清除活性氧的功能,是植物抵御盐胁迫的重要途径[10-12]。如图6所示,在NaCl胁迫处理下,盐敏感品种6014和6008体内CAT酶活性分别显著下降了57.23%和56.46%(图6A),POD酶活性分别下降了57.66%和53.86%(图6B);而耐盐品种6204和6101体内CAT酶活性则分别增加了36.72%和8.68%(图6A),POD酶活性分别显著增加了68.55%和33.05%(图6B)。上述结果表明:在NaCl胁迫下盐敏感品种的抗氧化酶活性显著下降,导致不能及时清除体内积累的活性氧,而耐盐品种能够明显激活抗氧化酶活性,从而较好地抵御活性氧对膜脂的氧化伤害。

图6 NaCl胁迫处理对浮萍过氧化氢酶(A)和过氧化物酶(B)活性的影响

3 讨论

叶绿素是一种重要的植物光合色素,其含量不仅能够直接影响植物光合效率和生物量的积累,而且还能够反映植物遭受逆境胁迫的损伤程度。浮萍是一种漂浮在水面上生长的单子叶植物,结构简单,只有叶状体和退化的根系组成,叶状体是养分吸收的主要器官[7]。因此,叶状体能够快速响应盐胁迫造成的生理损伤,并通过检测叶绿素含量反应浮萍植株的耐盐性。本研究利用200 mmol/L NaCl筛选12份浮萍种质资源,分别获得耐盐(6204和6101)和盐敏感(6014和6008)品种各两个。进一步发现耐盐品种6204和6101的叶绿素a含量分别下降了56.99%和56.46%,叶绿素b含量下降了49.11%和50.73%;而盐敏感品种6014和6008的叶绿素a含量则分别下降了83.83%和86.91%,叶绿素b含量下降了77.98%和77.37%(图2)。以上结果表明,耐盐品种叶绿素a、b含量下降幅度明显低于盐敏感品种。因此,叶绿素含量是鉴定浮萍耐盐性的一种快速、简单、直观、有效的实验方法,这将对大规模筛选耐盐浮萍品种资源具有重要的指导意义。

植物在遭受盐胁迫损伤时常会发生活性氧(ROS)的积累,ROS会攻击细胞内的核酸和蛋白质,造成色素降解、膜脂过氧化和细胞膜透性增加等伤害[13]。丙二醛含量是反映细胞膜过氧化程度的重要指标,其含量越高表明植物细胞膜受到的损伤程度越高。与盐敏感品种相比,耐盐品种具有较低的丙二醛含量和细胞损伤度,表明耐盐品种受到较轻的氧化胁迫损伤。在高盐胁迫过程中,植物体内的生理代谢会发生适应性变化以缓解氧化胁迫,如激活抗氧化酶系统、增加渗透调节物质含量等[13]。有研究表明,与盐敏感高粱品种相比较,耐盐高粱品种积累更多的渗透调节物质,比如脯氨酸和可溶性蛋白等[14-15]。高粱幼苗中,抗氧化酶SOD、CAT、POD和APX活性随着盐浓度的增加而提高,特别是耐盐高粱品种[13]。本研究显示,在200 mmol/L NaCl胁迫下盐敏感品种没有大量脯氨酸的积累,抗氧化酶CAT和POD活性均显著下降,导致细胞损伤度高达90%以上;而耐盐品种6204和6101通过积累大量脯氨酸,增强抗氧化酶CAT和POD活性以保护细胞膜的完整性,进而缓解细胞膜损伤,有效适应高盐胁迫环境,表现出较好的耐盐能力。

4 结论

本文利用200 mmol/L NaCl筛选12个浮萍品种,获得适合盐碱地水资源培养的耐盐浮萍品种‘Lemna 6204’‘Lemna 6101’,研究认为耐盐浮萍是通过积累大量脯氨酸和激活抗氧化酶活性,维持细胞膜的完整性,进而缓解叶绿素降解,表现出较好的耐盐能力。