联合代谢产物和重要农艺性状鉴定不同雪茄烟品系

李雪山 黄德文 吕芳 周会娜 李洋洋 任云见 豆长辉 晏剑 宁扬 戴培刚 张兴伟

摘  要：基于代谢组学技术，筛选与优良感官质量相关代谢物丰富、具有优质高产潜力的雪茄烟品系。以7个不同雪茄烟品系为材料，在湖南桂东调查了其田间农艺性状，分析了其代谢物组成及其积累差异。结果表明，QX104和QX106在农艺性状上优于其他5个品系，叶长、叶宽和可采叶片数优势明显，更符合高產的种植目的，在代谢物积累水平上也与其他品系存在显著差异。在定性检测到的183种代谢物中，与其他品系相比，QX104有36%的代谢物上调，QX106有24%的代谢物上调，上调的代谢物主要包括有机酸、醇类、酮类、糖类等物质，有助于提升烟叶感官质量。研究表明QX104和QX106农艺性状优良，与优良感官质量相关的代谢物质丰富，为湖南烟区具有高产优质生产前景的雪茄烟品系。

关键词：雪茄烟；代谢组学；农艺性状；差异代谢物；通路分析

中图分类号：TS424                         文献标识码：A                     文章编号：1007-5119（2023）05-0094-09

Identification of Different Cigar Lines by Combined Analysis of Metabolites and Important Agronomic Traits

LI Xueshan， HUANG Dewen， LYU Fang， ZHOU Huina， LI Yangyang， REN YunJian， DOU ChangHui，

YAN Jian， NING Yang， DAI Peigang， ZHANG Xingwei

（1. Institute of Tobacco Research of CAAS， Qingdao 266101， China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China; 3. Guidong Branch， Hunan Tobacco Company of CNTC， Chenzhou， Hunan 423500， China; 4. Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC， Zhengzhou 450001， China; 5 Hunan Tobacco Research Institute， Changsha 410004， China; 6. Pengshui Branch， Chongqing Tobacco Company of CNTC， Chongqing 409600， China）

 Based on metabolomics technology， cigar lines with high quality and high yield potential with rich metabolites related to good sensory quality were screened. The field agronomic characteristics of 7 cigar lines were investigated in Guidong， Hunan Province， and the differences of metabolic product composition and accumulation were analyzed. The results showed that QX104 and QX106 were superior to the other five lines in agronomic traits， with obvious advantages in leaf length， leaf width and number of available leaves， which were more in line with the planting purpose of high yield， and there were significant differences in metabolite accumulation levesl with other lines. Among the 183 metabolites qualitatively detected， 36% of the metabolites in QX104 and 24% in QX106 were up-regulated compared with the other lines. All the up-regulated metabolites were helpful in improving the smoking quality of tobacco leaves. The results showed that QX104 and QX106 had excellent agronomic properties and abundant organic acids， alcohols， and carbohydrate metabolites. They were cigar lines with high yield and high-quality production prospects in Hunan tobacco areas.

cigar; metabolomics; agronomic traits; differential metabolite; path analysis

基金项目：中国烟草总公司重大科技项目[110202101011（XJ-03）]；湖南省烟草公司郴州市公司项目（2021431027240001）；湖南省烟草公司项

目（HN2022KJ15）；中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-TRIC01）；山东省自然科学基金面上项目（ZR2022MC145）

作者简介：李雪山（1998-），硕士研究生，研究方向为雪茄烟遗传育种。E-mail：82101215174@caas.cn

*通信作者。E-mail：戴培刚，daipeigang@caas.cn；张兴伟，zhangxingwei@caas.cn

收稿日期：2023-05-06                修回日期：2023-09-19

雪茄是一种全部用烟叶卷成的烟草产品。国内雪茄烟市场不断扩大，雪茄消费正从少数人群逐渐向大众群体延伸。培育具有自主知识产权且符合国内生态环境的雪茄烟新品种，是解决雪茄生产水平不足的重要方式，也是国产雪茄烟高质量发展的必由之路。由于受气候、土壤、地形和种植经验的影响，只有少数国家少数地区才能生产出高品质的雪茄烟叶。湖南桂东与古巴气候相似，具有生产优质雪茄的潜力，可作为发展雪茄生产的区域之一。

植物代谢组学是对植物特定组织中整体代谢水平的检测，具有整体性、高通量和无偏向性等特点，已广泛应用于植物科研领域。郑庆霞等对烟叶进行了代谢水平的检测并开发了一系列烟草代谢组检测和分析方法。李楠芬等、杨荣洲對雪茄烟进行了非靶向代谢组学检测分析，探究了不同雪茄烟品种代谢物差异及其对雪茄烟质量的重要性。然而，目前雪茄烟品种选育未能与代谢组学深入结合，通过代谢组学技术研究雪茄烟代谢产物积累水平，并结合重要农艺性状进行品系鉴定和品种选育的报道较为鲜见。本研究以7个雪茄烟品系QX103、QX104、QX105、QX106、QX107、QX205、QX208为试验材料，在湖南桂东地区种植，依据农艺性状和代谢物进行聚类分析，以期筛选出农艺性状好、内含代谢物丰富的雪茄烟品系，推动雪茄烟育种从表型深入到微观，为优质品种筛选提供依据。

1  材料与方法

1.1  供试材料

7个来源于国家烟草种质资源中期库的不同雪茄烟品系（表1），于2022年种植于湖南省郴州市桂东县普乐镇堡下村。土壤主要理化性状：pH 4.94，含速效磷92.90 mg/kg、速效钾106.33 mg/kg、水解氮175.81 mg/kg、有机质25.30 g/kg、氯离子33.72 mg/g、有效硫12.27 mg/kg、全硫867.14 mg/kg。

1.2  试验设计

随机区组设计，3次重复，每个品系每个重复种植面积200 m，行距110 cm，株距40 cm，茄衣用肥：饼肥1500 kg/hm、碳基肥4500 kg/hm、硝酸钾330 kg/hm、硝酸钙450 kg/hm、硝酸镁300 kg/hm、硫酸钾600 kg/hm、硼砂15 kg/hm。

1.3  试验方法

1.3.1  农艺性状调查  在各品系中心花开放期，按照《烟草种质资源描述规范和数据标准》进行农艺性状调查，包括叶长、叶宽、叶片数、叶片厚度、株高、茎围、节距、支脉粗细、主脉粗细、支脉数、主侧脉夹角和茎叶夹角。

1.3.2  样品采集  7个雪茄烟品系中部叶片采收后在晾房内采用“五段式”晾制工艺进行晾制。晾制后，每个品系采集大小、色泽、成熟度一致的中部叶片15～20片，置于40 ℃烘箱中烘干3 h，每2～3片叶片去除主侧脉后混为一个生物学重复，独立粉碎研磨后置于−80 ℃冰箱保存备用。分别利用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱法（HS-SPME-GC-MS）和柱前衍生化GC-MS技术对挥发性和半挥发性代谢物进行检测。

其中衍生化GC-MS测定设置3个生物学重复，不均匀称取每个样本进行混合，制成QC样本。顶空固相微萃取GC-MS测定设置2个生物学重复。

1.3.3  烟叶代谢物提取  （1）半挥发性代谢物提取。取烟叶粉末20 mg于2 mL离心管中，加入1.5 mL由异丙醇、乙腈和水3∶3∶1混合制成的萃取溶剂，冰浴超声1 h；室温下14 000 r/min离心10 min；取500 µL上清液至2 mL锥形玻璃进样瓶中，真空浓缩干燥约4 h；加入100 µL的20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液，37 ℃ 200 r/min下孵育90 min；加入100 µL硅烷化试剂BSTFA，60 ℃ 200 r/min摇床硅烷化60 min。

（2）挥发性代谢物测定中直接称取1 g烟叶粉末置于顶空-固相微萃取装置的进样瓶后进行萃取和检测。

1.3.4  GC-MS检测  使用Agilent7890/5975C型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司），色谱条件参考ZHAO等，色谱柱为DB-5MS柱（0.25 μm，0.25 mm×30 m）；载气为氦气；柱流速1.2 mL/min；进样口温度300 ℃；进样体积1 μL；分流比10∶1；检测器电压保持在1.2 kV，选择电子冲击（EI）模式以实现70 eV的电离。质谱条件为：离子源为正EI源；离子源温度230 ℃；采集类型为SIM和扫描模式；扫描起点质量33.00 /，扫描终点质量600.00 /。每检测6个样品插入一个QC。

1.4  数据处理与分析

利用Excel进行数据整理。农艺性状数据采用Excel方法进行分析。

参考郑庆霞等的方法对代谢物数据进行预处理。使用NIST质谱数据库对代谢物进行定性分析，对80%样品中均存在的特征峰进行提取，并确定代谢物种类。

利用SIMCA14软件对代谢组数据进行主成分分析（PCA），对数据进行模式识别，考察各组样品代谢物的分离情况。在PCA分析的基礎上，采用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），再根据其分组贡献值（VIP）和组间变化（），以VIP≥1，＞1.5或＜0.67的标准筛选差异代谢物。利用TBtools（v1.082）进行热图（Heat Map）绘制，MetaboAnalyst 5.0进行相关通路分析。

2  结  果

2.1  各雪茄烟品系农艺性状调查结果

对农艺性状进行方差分析（表2）并依据农艺性状数值进行聚类热图绘制（图1）。结果表明，7个雪茄烟品系中，QX104和QX106聚为一类；QX107、QX208、QX103聚为一类，QX105和QX205聚为一类。QX106的株高、茎围、可采叶片数、叶长、叶宽、主侧脉夹角以及叶长支脉比等农艺性状数值显著高于其他品系，且叶片最薄、支脉最细，茎叶夹角适中。QX104在株高、茎围、叶长、叶宽、叶长支脉比等农艺性状上与QX106以外的品系相比存在显著差异。两个品系在各重要农艺性状上，均优于对照品系QX103。

2.2  雪茄烟各品系半挥发性谢物检测及聚类分析

通过衍生化GC-MS技术对7个品系雪茄烟半挥发性代谢物进行定性检测，共获得128种代谢物，其中包括41种有机酸、25种糖类、20种醇类、11种氨基酸类、8种酰胺类、4种酯类、3种酮类以及16种其他类型代谢物。对所有样本的代谢组数据进行PCA分析（图2），QX103、QX107、QX205、QX208、QX105五个品系雪茄烟在PCA得分图上呈现一定程度的聚集；而QX104和QX106在PCA得分图上的位置与其他5个品系雪茄烟存在一定的位置差异，尤其是QX104的3次重复明显与其他品系分散，单独聚为一类。

2.3  雪茄烟各品系挥发性代谢物检测及聚类分析

通过顶空固相微萃取GC-MS技术对7个雪茄烟品系易挥发代谢物进行定性检测，共获得55种代谢物，其中包括12种酮类、9种烷烃类、7种醇类、6种酯类、5种有机酸、3种醛类、2种酰胺类、1种醚类以及10种其他类型代谢物。由图3可知，QX103、QX107、QX205、QX208、QX105五个雪茄烟品系在PCA得分图上同样呈现一定程度的聚集。而QX104和QX106在PCA得分图上的位置与其他5个品系雪茄烟同样存在一定的位置差异，其中QX104的两次重复与其他品系存在明显的分离趋势。

2.4  QX104和QX106与其他品系的差异代谢物

将柱前衍生化GC-MS和顶空固相微萃取GC-MS代谢物数据汇总得到182种代谢物，根据PLS-DA的VIP和值筛选QX104和QX106与其他5个品系的差异代谢物。PLS-DA可视化结果显示（图4），QX104和QX106与其他5个品系雪茄烟在代谢物组成上存在明显差别，可进一步对其进行差异代谢物筛选，并分析差异代谢物的类型和功能。

由于QX104和QX106不仅与其他品系在代谢物积累上存在差异，同时二者相互之间也存在差异，故先将二者分别与其他5个雪茄烟品系比对，筛选差异代谢物，再综合二者重合部分来进行后续分析。

2.4.1  QX104与其他品系的代谢物差异  如图5及表3所示，QX104与其他5个品系雪茄烟相比，总共有79种差异代谢物。其中包括19种有机酸、17种醇类、8种酮类、5种烷烃类、5种烯烃类、4种氨基酸类、4种糖类、4种酰胺类、3种酯类、1种醛类、以及9种其他类型代谢物。其中与感官质量相关的代谢物差异情况如表3所示。

2.4.2  QX106与其他品系的代谢物差异  如表4及图6所示，QX106与其他5个雪茄烟品系相比，总共有57种差异代谢物，包括16种有机酸、11种糖

类、7种醇类、6种酮类、3种酰胺类、3种烷烃类、2种醛类、2种氨基酸类、1种烯烃类以及6种其他类型代谢物。其中与烟草感官质量相关的部分代谢物差异情况如表4所示。

2.4.3  QX104和QX106共有的差异代谢物  以VIP≥1，＞1.5或＜0.67的代谢物含量差异倍数关系为标准，筛选差异代谢物。QX104和QX106与其他5个雪茄烟品系相比，共有15种相同的差异代谢物（表5）。其中2-环己烯-1-酮下调，其余14种上调。

2.5  差异代谢物代谢通路分析

为进一步了解差异代谢物相关代谢途径的变化，将QX104和QX106的共同差异代谢物映射到MetaboAnalyst 5.0的KEGG数据库中。如图7所示，主要富集到前25%代谢通路为丙酮酸代谢通路、糖酵解/糖新生通路、半乳糖代谢通路、乙醛酸和二羧酸代谢通路、不饱和脂肪酸的生物合成途径。其中丙酮酸代谢通路值为0.042 4，品系间差异显著。

3  讨  论

糖类物质是烟草中含量和种类最为丰富的香气前体物质，在烟草香气品质形成过程中发挥着重要作用。酮类物质具有显著致香作用，可以使烟叶具有不同香气特征。烟叶中含有丰富氨基化合物，会发生一系列美拉德反应，对烟叶品质产生显著影响，氨基酸含量的高低直接影响到烟的味道和烟气的丰满度。醇类物质是植物生长的调节剂以及烟草香气物质的前体物。与其他5个品系相比，在定性检测到的183种代谢物中，QX104总共有79种差异代谢物，其中65种上调，上调比例82%，上调代谢物中主要有17种醇类、9种酮类；QX106

总共有57种差异代谢物，其中44种上调，上调占比为77%，上调代谢组主要包括11种糖类、8种醇类。两品系在醇類、糖类和酮类代谢物上更为富集。在14种共同上调代谢物中，鼠李糖主要对香气质、余味和总分指标有较大影响；1-戊醇是一种香料成分，在工业生产中得到广泛应用；酮类物质作为一种香薰物质，被认为是许多植物中的关键风味化合物；由于其吸引人的感官特性受到工业的高度认可；咖啡酸及其衍生物可以使植物具有较强的抗菌特性，已被大量当作抗菌剂使用。上调代谢物使得2个品种更加具有提升雪茄感官质量的基础条件。

烟叶种植的目的是收获烟草叶片，叶面积和叶片数是构成烟草产量最直接的性状，与烟农经济收入直接相关。QX104和QX106在重点关注的与收获指标相关的农艺性状上，与对照品系QX103及其他品系相比均具有明显优势，其中QX106具有24.4片可采叶片数，叶长和叶宽分别为61.13 cm和38.8 cm，均显著高于其他品系，具有最大的收获潜力。从农艺性状角度出发，QX104和QX106符合高产的种植目的，具有扩大种植的价值。

4  结  论

湖南桂东的7个不同雪茄烟品系中，QX104和QX106在重要农艺性状上显著优于其他5个品系；与优良感官质量相关的代谢物积累更为丰富，含量明显上调，具有高产优质的潜力。

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