酶水解制备罗非鱼皮胶原蛋白肽的工艺优化

邓 云，梁权瑞，邓琳琪

（1.茂名市食品药品检验所，广东茂名 525000；2.广东石油化工学院，广东茂名 525000）

胶原蛋白肽不但具有多肽的一些典型特征[1]（包括分子量小、易吸收，无抗原性、不过敏，安全性高、无副作用，生物活性高、作用准确、载体运输能力强等） 外，还具备其他多肽没有的一些优点（显著的美容功效、促进骨骼的生长的修复等），被称为“皮肤的软黄金”“肤中之肤、骨中之骨”，广泛用于化妆品[2-3]、功能性食品[4-5]、医用材料及医药中[6-7]。胶原蛋白肽的研究对人类来说是一项非常值得研究的内容[8]，罗非鱼含有丰富的胶原蛋白，具有很多陆生动物胶原蛋白所没有的优点，是提取可溶性胶原蛋白既丰富又经济的原料[9]。罗非鱼加工过程中会舍弃富含胶原蛋白的鱼皮，目前只有一小部分用于制作饲料或者肥料，绝大部分当作废物丢弃，从而污染环境，造成了巨大资源浪费。希望能够为罗非鱼皮的胶原蛋白肽提取方法和价值提供一定的依据和参考。

1 材料与方法

1.1 酶的选择

胰蛋白酶Trypsin（Parenzyme） 是蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，其不仅起消化酶的作用，还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，成为不可缺少的工具。胰蛋白酶在生活中也较容易得到，性价比较高。同时，胰蛋白酶的最适pH 值为7.0～8.5，最适温度为40～70 ℃，上述条件在实验室均比较容易达到，所以此次罗非鱼鱼皮明胶酶解选取胰蛋白酶。

1.2 材料和试剂

1.2.1 材料

罗非鱼皮明胶液体（质量分数约为6%），广东百维生物科技有限公司提供；胰蛋白酶（酶活力为265 U/mg），上海源叶生物科技有限公司提供。

1.2.2 试剂

无水硫酸铜（AR），广东光华科技股份有限公司提供；三氯乙酸（AR），永华化学科技（江苏） 有限公司提供；磷酸氢二钠（AR）、磷酸二氢钠（AR），天津市永大化学试剂有限公司提供；氢氧化钠（AR）、酒石酸钾钠（AR），天津市大茂化学试剂厂提供；盐酸（AR），西陇化工股份有限公司提供。

1.3 仪器及设备

UV-2600 型紫外可见分光光度计，岛津仪器（江苏） 有限公司产品；HWS-26 型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司产品；LGJ-10 型冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司产品；BSS224S 型电子分析天平，北京赛尔多斯仪器系统有限公司产品；80-2 型电动离心机，天津市永常州澳华仪器有限公司产品；pHS-2F 型pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；1515 GPC 型凝胶色谱柱、717plus 型自动进样器、Agilent 1260 型示差检测器，美国Waters 产品。

1.4 试验流程及操作要点

1.4.1 试验流程

6%的明胶液→放进冰箱急冻层冻结后→冻结后切块再放进去冻结→冻结后放进冷冻干燥机干燥→电子天平称质量→加缓冲液溶解→加入胰蛋白酶反应→取样加入质量分数为14%的三氯乙酸溶液终止反应→静置10 min 后离心→上清液取样加TCA 和双缩脲试剂→加氢氧化钠调节pH 值→在分光光度计测量吸光度→数据处理。

1.4.2 操作要点

（1） 明胶称质量。选取完全干燥的明胶固体置于干净的100 mL 烧杯中，准确称取所需质量的明胶，误差不要超过0.01 g。

（2） 加缓冲液溶解。以30 mL 作为体系，向称好干燥明胶的小烧杯中加入缓冲溶液，用保鲜膜盖住烧杯口，放置于水浴锅中完全溶解。

（3） 加胰蛋白酶进行反应。加入酶液的第一时间开始计时，在确定的时间点准确对反应溶液进行取样，并且在第一时间加质量分数为14%的TCA（三氯乙酸） 终止反应，静置10 min 沉淀。

（4） 离心。离心后取上清液3 mL 置于一次性杯子中，加入15 mL 的质量分数14%的TCA 溶液（再次加入TCA 是为了保证体系内没有受到胰蛋白酶的影响） 和12 mL 现配的双缩脲试剂。

（5） 测量。用氢氧化钠溶液把该体系的pH 值调至12.5，并尽快对其进行吸光值测量，要求平行测量3 次后取平均值。

1.5 鱼皮明胶酶解条件优化

采取单因素试验，在其他条件不变的情况下，分别研究明胶质量分数、胰蛋白酶用量、反应环境pH 值和反应环境温度4 个因素对胰蛋白酶酶解罗非鱼鱼皮酶解的影响。在单因素试验结果的基础上，每个因素中选取5 个水平进行响应面法设计。根据响应面法试验结果来分析，并找出胰蛋白酶酶解罗非鱼鱼皮明胶的最优条件。

1.5.1 单因素试验

（1） 最适明胶质量分数。根据文献[10]的方法，取1.5 g 干燥后的明胶置于1 号、2 号烧杯中，2 个烧杯中各加入28 mL pH 值7.4 缓冲液。溶解后向2 号烧杯加入2.0 mg/mL 胰蛋白酶液0.5 mL（对应的就是体系中用量0.033 0 mg/g），混匀后置于60 ℃的温度水浴锅中反应，立即计时。反应至10，20，30，40，60，90，120 min 时取样测量，测量方法参考改良双缩脲法测量多肽含量。其余明胶质量分数分别是6%，7%，8%，9%，10%，分别对应的明胶用量为1.8，2.1，2.4，2.7，3.0 g，对应的缓冲液分别是27.7，27.4，27.1，26.8，26.5 mL，测定方法与质量分数5%明胶一致。

（2） 最适酶用量。明胶质量分数选取7%，体系确定是30 mL，取2.1 g 干燥后的明胶置于1 号，2 号烧杯中，酶液用量换成液0.1，0.3，0.4，1.2，2.0 mg/mL的胰蛋白酶液0.50 mL（对应体系中的酶用量是0.001 7，0.005 0，0.006 7，0.020 0，0.033 0 mg/g），于60 ℃的温度水浴锅中反应，立即计时。反应至10，20，30，40，60，90，120，150，180，210 min时取样测量，测量方法参考改良双缩脲法测量多肽含量。

（3） 最适反应温度。明胶质量分数选取7%，酶用量选取2.0 mg/mL 胰蛋白酶液0.5 mL，在40 ℃的恒温水浴锅中反应，立即计时，反应至10，20，30，40，60，90，120，150，190 min 时取样测量，测量方法参考2.6.3 的改良双缩脲法测量多肽含量。其余反应温度分别是50，60，70，80 ℃，测定方法同测40 ℃的方法一致。

（4） 最适反应pH 值。明胶质量分数选取7%，酶用量选取2.0 mg/mL 胰蛋白酶液0.5 mL，反应温度选取40 ℃，换用pH 值（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）缓冲液，于最适温度下反应，立即计时，反应至10，20，30，40，60，90，120，150，190，230 min 时取样测量，测量方法参考改良双缩脲法测量多肽含量。

1.5.2 响应面法优化试验

由于单因素试验数据分析得到，明胶质量分数、反应温度、酶用量和缓冲溶液pH 值这4 个因素对明胶酶解后的肽得率的影响较明显。故选取明胶质量分数、反应温度、酶用量、缓冲溶液pH 值及不同反应时间这5 个因素，利用Design Expert 10.0 这个软件进行五因素五水平的响应面法设计。

1.6 罗非鱼鱼皮明胶分子量分布的检测

1.6.1 测定方法

采用凝胶渗透色谱（GPC） 测定。流动相为0.1 mol/L 的KNO3水溶液，凝胶柱为WATERS Ultrahydrogel 500 column（7.8 mm×300 mm）、WATERS Ultrahydrogel 250 column（7.8 mm×300 mm） 和WATERS Ultrahydrogel 120 column（7.8 mm×300 mm）串联合用，流速为1.0 mL/min，Agilent 1260 示差检测器，柱温40 ℃。

标准品：已知分子量（Mw） 的聚乙二醇，分子量分别为152 000，78 300，44 000，32 600，25 300，20 600，12 600，7 130，4 290，1 960，1 400，430，202 Da。

1.6.2 标准曲线的制备

以流动相为溶剂将其溶解为2 mg/mL 的标准溶液，用0.45 μm 的膜过滤后，用高效凝胶色谱（GPC） 系统进行检验分析，OPEN LAB CDS 数据处理软件处理数据。以标准品相对分子质量的对数（LogMw） 对洗脱体积（V） 建立回归方程，即得到标准曲线。

1.6.3 样品测试

将明胶样品用流动相溶解，终质量浓度为2～3 mg/mL，0.45 μm 的膜过滤后，进样量40 μL，运行时间40 min，记录图谱，在OPEN LAB CDS 数据处理软件中用标准曲线对样品进行积分，可得明胶样品的分子量大小及分布。

1.7 肽得率的计算

1.7.1 双缩脲溶液的配制

取10%氢氧化钠溶液300 mL，另取3.0 g 无水硫酸铜和6.4 g 酒石酸钾钠加蒸馏水溶解定容至500 mL，在搅拌中加入氢氧化钠，后定容至1 000 mL。现配现用。

1.7.2 明胶酶解肽的标准曲线的绘制

用标称分子量为3 kDa 的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽配置成5 mg/mL 的肽液，分别取1.2，2.4，3.6，4.8，6.0 mL 于50 mL 的烧杯中，再分别加入8.8，7.6，6.4，5.2，4.0 mL 质量分数14%的TCA 溶液，然后加入8 mL 双缩脲试剂，使体系肽的质量浓度为0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mg/mL（控制多肽和TCA 溶液的总体积与双缩脲溶液体积比为3∶2）。将溶液的酸碱度调至pH 值至10.5，立即于波长545 nm 处测定吸光度，以肽的质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

参比液为空白溶液，做3 组平行试验。按照同样的方法分别测出溶液pH 值为11.0，11.5，12.0，12.5，13.0，13.5 的对应溶液的回归方程。

根据回归方程的相关系数的平方和试验测得数据来选取最后的溶液pH 值，通过试验数据和相关系数R2的大小，最后选取的是溶液pH 值是12.5，回归方程是：

式中：A——样品吸光度。

1.7.3 改良双缩脲法测量多肽含量[11]

干燥的明胶经过加入缓冲液溶解，再加入指定的胰蛋白酶液经过一定的时间反应后，取出的1 mL样液于离心管中，加入质量分数为14%的三氯乙酸溶液10 mL 后，静置10 min 后以转速3 250 r/min离心15 min，直至沉淀完全。取上清液3 mL 加入100 mL 烧杯中，加入TCA 溶液15 mL，加入双缩脲试剂10 mL，在这时要提前半个小时去预热分光光度计，然后对溶液进行调pH 值至12.50，并立即于波长545 处测吸光度。要求每次都要重复试验3 次，取平均值。

1.7.4 明胶酶解后肽得率的计算

式中：A——样品吸光度；

31.8——体系溶液30 mL 中经过调完pH 值后的体积，mL；

11——1 mL 样液+10 mL 的14%的TCA，mL；

M——干燥明胶的质量，g。

2 结果与分析

2.1 明胶分子量分布结果

罗非鱼皮明胶凝胶色谱图见图1，罗非鱼鱼皮明胶GPC 结果参数见表1。

图1 罗非鱼皮明胶凝胶色谱图

由图1 和表1 可知，罗非鱼皮明胶的凝胶色谱图的Mw（重均分子量） = 27 759 Da，Mn（数均分子量） =16 578 Da，Mp（质均分子量） =36 524 Da，Mw/Mn（多分散系数） =1.674 5。由此可得，罗非鱼皮明胶的分子量比较集中，罗非鱼皮明胶不是一个均一的分子量聚合物，分子量宽度还可接受，分散程度不是很大。

2.2 罗非鱼明胶水解工艺单因素结果及分析

2.2.1 酶解明胶质量分数对胶原蛋白肽得率的影响

酶解明胶质量分数对胶原蛋白肽得率的影响见图2。

图2 酶解明胶质量分数对胶原蛋白肽得率的影响

由图2 可知，罗非鱼鱼皮明胶同一质量分数下随酶解时间的延长，肽得率随之增大，最后会趋于稳定。而在相同时间内，明胶质量分数的增大，肽得率先增大后减小，在明胶质量分数超过7%后，肽得率下降可能是胶原蛋白质量分数较高，导致溶液黏稠度增大、流动性降低，减少了酶与明胶底物的接触，导致明胶酶解率降低，肽得率下降，与Motero P 等人[12]的研究结果相似。

2.2.2 酶解酶用量对胶原蛋白肽得率的影响

酶解酶用量对胶原蛋白肽得率的影响见图3。

图3 酶解酶用量对胶原蛋白肽得率的影响

由图3 可知，罗非鱼鱼皮明胶在不同酶用量、相同时间下通过酶解提取的蛋白肽含量不同。同一酶用量下随着酶解时间延长，肽得率增大，最后趋于稳定，并且在20.0 μg/g 时得到最大肽得率，在继续增加酶用量的情况下，肽得率不会增加，可能20.0 μg/g 的用酶量就是这个反应体系中酶的最大用量，即在最大用酶量之前，明胶的酶解速率由胰蛋白酶的数量来控制明胶酶解后的肽得率；当超过最大酶用量，由明胶底物质量分数来决定明胶酶解肽得率。

2.2.3 酶解温度对胶原蛋白肽得率的影响

酶解温度对胶原蛋白肽得率的影响见图4。

由图4 可知，罗非鱼鱼皮明胶在温度一定时，随着酶解时间增大，肽得率也随之增大，最后趋于稳定，其中在70 ℃时胶原蛋白肽得率可达到最大，但超过70 ℃后，肽得率反而降低。这是因为当温度超过了一定范围后胰蛋白酶的酶活性会降低，相同时间内酶解效率有所降低，导致肽得率下降。

2.2.4 酶解pH 值对胶原蛋白肽得率的影响酶解pH 值对胶原蛋白肽得率的影响见图5。

图5 酶解pH 值对胶原蛋白肽得率的影响

由图5 可知，罗非鱼鱼皮明胶在同一pH 值下均随酶解时间的增加，肽得率增大，后趋于稳定。相同时间下，随着pH 值的增大，肽得率是先增大后减小，在pH 值为7.0 时鱼皮明胶酶解后蛋白肽得率达到最大。

2.3 响应面法优化酶解提取罗非鱼皮胶原蛋白的试验结果

根据单因素的试验结果可知，酶用量、酶解温度、时间、体系中pH 值及明胶质量分数对肽得率的影响十分显著。采用Design Expert 10.0 软件Central composite 设计五因素五水平的响应面试验，以多肽得率作为响应值，应用五因素五水平处理，共有32 个处理试验，其中中心点重复6 次。

响应面中心设计试验因素与水平设计见表2，响应面试验设计与结果见表3。

表2 响应面中心设计试验因素与水平设计

表3 响应面试验设计与结果

2.3.1 试验数据处理及数值分析

根据试验数据，通过Design Expert 10.0 软件能够得到一个三维的响应面，以此分析整体误差水平，再经过响应面优化能得到酶解提取罗非鱼皮胶原蛋白肽的最佳工艺条件。以肽得率为响应值得到二阶多项方程为：

Y=75.14+1.18A+3.11B-3.70C+6.0D+6.91E+3.72AB-2.95AC+2.01AD+1.16AE-1.55BC-1.90BD+2.71BE+2.91CD-0.21CE-0.43DE-12.35A2-7.81B2-2.52C2-2.79D2-4.80E2.

试验设计与结果见表4。

由表4 可知，5 个因素对罗非鱼鱼皮明胶酶解后胶原蛋白含量影响顺序为E＞D＞C＞B＞A，在5 个因素中，酶用量（D） 和时间（E） 的p 值（p＜0.000 1），说明这2 个因素对鱼皮明胶酶解肽得率中具有极其显著的影响。失拟项p=0.063 4＞0.05 不显著，没有失拟因素存在，对模型是有利的。校正决定系数R2Adj=0.928 2＞0.80 和CV=9.11%＜10%，拟合的回归方程符合实际要求，适应性较好，可以代替试验真实点对试验分析。

2.3.2 模型的响应曲面与等高线

根据Design Expert 10.0 软件可以得到根据二次方程模型分别做出的试验因素间交互作用的三维立体响应曲面和等高线图，2 种图能够考查在某个因素固定中心值不变的情况下，其他2 个因素的交互作用对肽得率的影响。

酶解温度和体系pH 值对肽得率的交互影响3D图和交互影响等高线图见图6，酶解温度和明胶底物浓度对肽得率的交互影响3D 图和交互影响等高线图见图7。

图7 酶解温度和明胶质量分数对肽得率的交互影响3D 图和交互影响等高线图

响应曲面的倾斜度确定两者对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡，说明两者交互作用越显著；等高线的形状为椭圆形表示因素的交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著[29]。由图6 可知，酶解温度和pH 值交互作用显著，但酶解温度的等高线更为紧密，故反应体系温度对肽得率的影响更大。由图7 可知，酶解温度和明胶底物质量分数对肽得率的交互作用显著，但明胶底物质量分数的等高线更为紧密，即明胶底物质量分数对肽得率的影响更大。等高线中最小椭圆的中心点为响应面最高点。

酶解温度和酶用量对肽得率的交互影响3D 图和交互影响等高线图见图8，反应体系pH 值和反应时间对肽得率的交互影响3D 图和交互影响等高线图见图9。

图8 酶解温度和酶用量对肽得率的交互影响3D 图和交互影响等高线图

图9 反应体系pH 值和反应时间对肽得率的交互影响3D 图和交互影响等高线图

由图8 可知，酶解温度和酶用量对肽得率的交互影响显著，其中酶用量的等高线更为紧密，即反应酶用量对肽得率的影响更大。由图9 可知，pH 值和时间对肽得率的交互影响较显著，其中反应时间的等高线更为紧密，即反应时间对肽得率的影响更大。

明胶底物质量分数和酶用量对肽得率的交互影响3D 图和交互影响等高线图见图10。

图10 明胶质量分数和酶用量对肽得率的交互影响3D 图和交互影响等高线图

由图10 可知，底物质量分数和酶用量对肽得率的交互影响显著，其中酶用量的等高线更为紧密，即酶用量对肽得率的影响更大。

3 结论

通过五因素五水平的中心组合设计，分析响应面的曲面和等高线的分布图得出各因素对肽得率的影响大小为时间＞酶用量＞明胶质量分数＞酶解pH值＞温度。由响应面的优化分析可以得到最佳酶解工艺条件为明胶胶质量分数6%，酶用量15.1 μg/g，酶解温度70.0 ℃，pH 值7.63 和时间69.99 min，在此最佳工艺条件下酶解罗非鱼皮明胶肽得率76.54%。考虑到实际操作的方便性和可操作性，将提取工艺条件改为酶解温度70.0 ℃，明胶质量分数6.0%，反应pH 值8.00，时间70.0 min，酶用量为20.0 μg/g时，明胶酶解的实际肽得率是77.72%。通过比较，实际得出的结果和理论值十分吻合，该模型的可靠性较高。