菌落浓度对肉桂酸钾及苯甲酸钠抑菌效果影响的分析

余春平，马齐兵

（武汉能迈科实业有限公司，湖北 武汉 430000）

食品防腐剂是一类可防止食品在贮存、流通过程中受到微生物增殖而引起变质的化合物，大部分防腐剂仅具有抑制微生物生长的作用，无杀菌作用，因此食品中初始菌落总数的高低可能会影响防腐剂的抑制作用。

肉桂酸又名桂皮酸、3 - 苯丙烯酸，是中药肉桂的有效活性成分。肉桂酸具有良好的抑菌、抗肿瘤、消炎等活性，被广泛应用于食品、医药等行业中。肉桂酸几乎不溶于水，实际应用时常使用钾盐，即肉桂酸钾[1]。

采用天然抑菌剂和防腐剂对食品进行防腐保鲜是食品加工过程中的常用手段，食品预处理也是重要的环节。苯甲酸钠和山梨酸钾因价格低廉且具有广谱的抑菌效果，食品行业将其作为首选防腐剂[2]，以大肠杆菌为指示菌，以天然抑菌物质肉桂酸钾、传统防腐剂苯甲酸钠为例，就初始菌落浓度对抑菌效果的影响进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

大肠杆菌（CMCC（B） 44103）；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、平板计数琼脂培养基，奥博星生物提供；75%乙醇、95%乙醇，武汉兴和达商贸有限公司提供；氢氧化钠、氯化钠，天力化学试剂公司提供；苯甲酸钠，万邦化工公司提供；肉桂酸钾，武汉能迈科实业有限公司提供。

BBS-DDC 型超净工作台，欧莱博科学仪器公司产品；DGL-35B 型高压蒸汽灭菌锅、FA1004 型电子天平，力辰仪器公司产品；DHP-360 型恒温培养箱，永光明医疗仪器公司产品；SZ-93 型自动双重纯水蒸馏器，亚荣生化仪器公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化培养

以大肠杆菌为试验指示菌，按许春芳等人[1]大肠杆菌活化培养的方法制备工作菌种。

1.2.2 培养基的制备

营养肉汤培养基（NB）、营养琼脂培养基（NA）、生理盐水、平板计数琼脂培养基（PCA） 制备方法参考GB/T 39101—2020。

1.2.3 不同浓度菌悬液的制备

（1） 无菌操作下取适量工作菌种溶解于100 mL NB 中，混合均匀，得大肠杆菌菌悬液。

（2） 预先按照GB 4789.2 中的操作方法进行大肠杆菌的菌落计数，于波长600 nm 处测定各浓度菌悬液的吸光度，根据对应的菌落计数值与吸光度建立相关性。根据相关性，将菌悬液调整至一定吸光度。

（3） 将上述菌悬液用无菌生理盐水稀释至10-1，10-2，10-3，制备成不同浓度菌悬液1（5×106CFU/mL），2（5×107CFU/mL），3（5×108CFU/mL）、4（5×109CFU/mL） 备用。

1.2.4 防腐剂溶液的配制

用生理盐水配制80 g/kg 苯甲酸钠、肉桂酸钾溶液；将2 组防腐剂用生理盐水逐级稀释至40 g/kg，10 g/kg。于121 ℃下高温灭菌15 min，备用。

1.2.5 检测平板制备

将灭菌后的NA 培养基冷却至45～50 ℃，放置到50 ℃水浴锅中备用，使用前表面喷上酒精，移入超净台；将制备的不同浓度菌悬液（按照1%添加量） 加入到NA 中制备成工作NA，缓慢地摇匀避免产生气泡，用灭菌的容器量取20 mL 工作NA 缓慢倒入灭菌平皿，轻轻摇动使之铺平，不能产生气泡，待冷却凝固后备用。

1.2.6 测定

用打孔器在工作平板上等距离打3 个孔（6 mm），量取样品20 μL，缓慢加入到孔中，每个样品做2 个平行。将平板移入4～6 ℃冰箱扩散2 h，取出平板放置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h 或至抑菌圈清晰，测量抑菌圈的直径，取平均值[3-4]。

2 结果与分析

2.1 肉桂酸钾和苯甲酸钠抑菌效果

在菌悬液浓度为3（5×108CFU/mL） 的培养基中，分别统计不同浓度下肉桂酸钾、苯甲酸钠抑菌圈直径。

肉桂酸钾、苯甲酸钠抑菌圈见图1，不同含量肉桂酸钾、苯甲酸钠对大肠杆菌抑菌作用见图2。

图1 肉桂酸钾、苯甲酸钠抑菌圈

图2 不同含量肉桂酸钾、苯甲酸钠对大肠杆菌抑菌作用

由图1 可知，在该菌悬液含量下，除10 g/kg 的肉桂酸钾和苯甲酸钠无抑菌圈，其余2 个含量均有抑菌圈，且肉桂酸钾抑菌圈直径在2 种含量下均大于苯甲酸钠，因此推测在相同菌落数条件下，同等含量的肉桂酸钾抑菌性大于苯甲酸钠。

因10 g/kg 时无抑菌圈，80 g/kg 时太高，选择40 g/kg 作为固定浓度（浓度4%），检测不同浓度菌落数对肉桂酸钾和苯甲酸钠抑菌性影响。

2.2 不同浓度菌悬液对肉桂酸钾、苯甲酸钠的抑菌性影响

绘制不同浓度大肠杆菌下4%浓度肉桂酸钾和苯甲酸钠的抑菌圈大小折线图。

不同菌落浓度下肉桂酸钾和苯甲酸钠抑菌效果见图3。

图3 不同菌落浓度下肉桂酸钾和苯甲酸钠抑菌效果

由图3 可知，随着菌落浓度的增加，肉桂酸钾和苯甲酸钠抑菌圈直径均减小，抑菌能力下降，且在菌落浓度为4（5×109CFU/mL） 时，抑菌圈消失抑菌效果较弱，证明肉桂酸钾和苯甲酸钠抑菌性和菌落初始数具有相关性，且初始菌落数越高其抑菌性越低。在菌落浓度低于4（5×109CFU/mL） 时，肉桂酸钾的抑菌性均强于苯甲酸钠，推测肉桂酸钾对初始菌落数的耐受性更强。

2.3 不同菌悬液浓度对肉桂酸钾、苯甲酸钠复配物抑菌效果的影响

防腐剂在实际应用中会根据食品性质进行复配，以求达到更好的防腐效果。复配后的防腐剂具有综合防腐性好、价格低廉等优点。研究验证了肉桂酸钾与苯甲酸钠复配对不同浓度菌悬液抑菌效果的影响。根据国家食品安全法规定，肉桂酸钾属于食品用香料，除GB 2760 规定不能使用食品香料目录中的食品，其他食品均可按照需求适量添加，因此肉桂酸钾与苯甲酸钠进行复配，可按照需求制定肉桂酸钾的量[5]。

将肉桂酸钾与苯甲酸钠按照1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1 的比例进行复配，得到5 组复配物。按照上述抑菌圈测定方法，测定在不同浓度大肠杆菌菌悬液浓度下4%浓度的5 组复配物的抑菌圈大小。

不同浓度菌悬液下5 组复配物的抑菌效果见表1，不同浓度菌悬液下5 组复配物的抑菌效果柱形图见图4。

表1 不同浓度菌悬液下5 组复配物的抑菌效果/CFU·mL-1

图4 不同浓度菌悬液下5 组复配物的抑菌效果柱形图

由表1 和图4 可知，5 组复配物在不同菌落浓度下，其抑菌效果均呈现下降趋势，且在浓度为4（5×109CFU/mL） 时均无抑菌圈。在浓度为1（5×106CFU/mL） 时，复配比例为2∶1 时抑菌效果最佳；当浓度为2（5×107CFU/mL） 时，复配比例为3∶1 时其抑菌效果最佳。从试验数据推断，虽复配比例和抑菌效果不呈正比例关系，但肉桂酸钾在复配时其添加比例超过50%时，在不同浓度菌液下的抑菌性更高。

3 结论

通过检测肉桂酸钾及苯甲酸钠对不同菌落浓度大肠杆菌的抑菌率，确定了菌落浓度对肉桂酸钾和苯甲酸钠抑菌性影响具有相关性：随着菌落浓度升高，肉桂酸钾和苯甲酸钠抑菌性相对减弱；另外，当防腐剂浓度一致时，肉桂酸钾对大肠杆菌的抑菌性优于苯甲酸钠。研究为肉桂酸钾的抑菌性能提供了试验依据，并验证了菌落浓度越高，对防腐剂抑菌效果的影响越大，防腐效果变差。为肉桂酸钾和防腐剂应用在食品中提供了数据参考，给“控制初始菌落数是食品防腐保鲜工艺中的重要因素”提供了依据。在实际应用中，肉桂酸钾可配合苯甲酸钠进行使用，其复配比例按照肉桂酸钾含量大于50%进行复配，其抑菌效果更好。