当归头基于BP-ANN结合信息熵赋权法 提取工艺参数优化

汪丽霞,徐志伟,黄 志,周一军,沈 忱,杜伟锋

(1.常山县农业特色产业发展中心,浙江 常山 324200;2.甘肃省中医院,甘肃 兰州 730000; 3.浙江中医药大学中药饮片有限公司,浙江 杭州 311401;4.常山天道中药饮片有限公司, 浙江 常山 324299;5.浙江中医药大学资产经营有限公司,浙江 杭州 311401; 6.浙江中医药大学 药学院,浙江 杭州 310053;7.浙江中医药大学 中药 炮制技术研究中心,浙江 杭州 311401)

当归是伞形科植物当归(Angelicasinensis(Oliv)Diels)的干燥根,是“根分梢理论”的代表药材[1]。《脾胃论》记载:“当归头止血上行,当归身补血中守,当归尾破血下流,全当归补血活血。”研究发现,当归头、身、尾两两配伍提取后,阿魏酸、绿原酸、欧前胡素、藁本内酯等主要化学成分含量和干浸膏得率均有不同程度降低,进一步说明当归不同药用部位分别应用与研究的必要性[2-4]。

目前尚无当归头系统提取工艺研究,故本研究拟以阿魏酸等4种主要化学成分含量及干浸膏得率为考察指标,以提取次数、加液量、提取时间为考察因素,运用BP-ANN结合熵权法优选当归头提取工艺。BP-ANN可较好满足非线性复杂问题的处理,符合中药提取复杂性、多元性要求[5-8]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PerkinElmer A-10型高效液相色谱仪(美国PerkinElmer公司);普利赛斯LX2200C电子分析天平(0.01g)(普利赛斯国际贸易有限公司);普利赛斯LX120A电子分析天平(0.0001g)(普利赛斯国际贸易有限公司);HWS26型电热恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司);HXGZ-000800电热恒温干燥箱(连云港医疗器械设备厂);KQZ3200E型超声波清洗机(连云港医疗器械设备厂)。

1.2 材料

1.2.1 当归头处理 当归药材采自甘肃陇西,经甘肃省中医院科研制剂中心李俊江主任中药师鉴定为正品当归药材。切下当归根上端膨大、钝圆,直径1.5～4cm,且残留叶鞘及茎基部分,即得当归头。

1.2.2 对照品及试剂 阿魏酸对照品(批号:110773-201614)、绿原酸对照品(批号:110753-201817)、藁本内酯对照品(批号:111737-201910)均购买自中国食品药品检定研究院,纯度均 ≥98%;甲醇、乙腈为色谱纯;水为纯净水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 指标成分测定

2.1.1 供试品溶液制备 平行精密称取当归头药粉9份,每份5g,置具塞锥形瓶中,精密加适量纯净水,按表1安排开展正交试验。提取液过滤,蒸干,纯甲醇溶解残渣,定容至25mL容量瓶,摇匀,过0.22μm微孔滤膜,即得供试品溶液。

表1 当归头L9(34)正交试验设计及结果

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取对照品适量,分别置10mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,摇匀,得质量浓度分别为阿魏酸0.33mg/mL、绿原酸0.73mg/mL、欧前胡素0.25mg/mL和藁本内酯2mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 色谱条件 WatersSymmetry Shield RP-C18(250mm×4.6mm,5.0μm)柱,DAD检测器,以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱:0～10min,12%～12% A;10～15min,12%～25% A;15～22min,25%～28% A;22～25min,28%～60% A;25～30min,60%～70% A;30～40min,70%～12% A;流速1mL/min,柱温25℃,检测波长350nm;进样量10μL。对照品、样品色谱见图1。

注:1-绿原酸;2-阿魏酸;3-欧前胡素;4-藁本内酯。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液适量,配制成6种不同质量浓度的混合对照品溶液,纯甲醇定容至刻度,摇匀,以“2.1.3”项下色谱条件测定。设横坐标(X)表示质量浓度,纵坐标(Y)表示峰面积开展线性回归,分别得回归方程:阿魏酸Y=2×107X-5 695.8,绿原酸Y=510 668X-1 335.2,欧前胡素Y=2×106X-7 013.4,藁本内酯Y=500 543X-5 717.4,即阿魏酸等在各自范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取某一供试品溶液10μL,以“2.1.3”项下色谱条件连续进针6次,测得各成分的峰面积RSD分别为阿魏酸1.03%、绿原酸1.01%、欧前胡素1.02%、藁本内酯1.05%,即仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精密称取当归头药粉,以“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液,依“2.1.3”项下色谱条件测定,得各成分含量RSD分别为阿魏酸1.33%、绿原酸0.51%、欧前胡素1.37%、藁本内酯0.69%,即方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取某一供试品溶液,于0、2、4、8、12、24h按“2.1.3”项下色谱条件测定,得各成分峰面积RSD分别为阿魏酸1.38%、绿原酸1.04%、欧前胡素0.22%、藁本内酯1.41%,即供试品溶液24h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 平行精密称取已知含量的当归头药粉9份,每份2g,随机分为3组,分别精密加入供试品中各成分量80%、100%、120%的各对照品溶液,以“2.1.3”项下色谱条件测定,计算回收率。得平均加样回收率分别为阿魏酸101.14%、绿原酸98.92%、欧前胡素101.15%、藁本内酯99.51%,RSD依次为0.12%、0.76%、1.10%、1.02%。即此含量测定方法准确度良好。

2.1.9 样品含量测定 以“2.1.3”项下色谱条件测定当归头9组正交提取样品中各成分的峰面积,外标法计算含量,依次设为阿魏酸Y1、绿原酸Y2、欧前胡素Y3、藁本内酯Y4,结果见表1。

2.2 干浸膏得率测定

精密称取当归头药粉5g,置150mL锥形瓶中,精密加适量水,密塞,称重,按表1试验安排加热回流,称质量,补足失重,摇匀,滤过,精密量取25mL滤液,置干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,于105℃干燥3h,干燥器中冷却30min,精密称定质量,计算数值,设为YG,结果见表1。

2.3 正交试验优化当归头的提取工艺

以单因素考察结果为依据,设提取次数(A)、加液量(B)、提取时间(C)为考查因素,并分设3个水平,见表1;以阿魏酸等4种化学成分含量和干浸膏得率为评价指标,按L9(34)设计试验,试验安排及结果见表1、表2。

表2 方差分析

2.4 阿魏酸等4种化学成分含量及干浸膏得率结果综合评价值计算

运用MATLAB R2012a软件编辑阿魏酸、绿原酸、欧前胡素、藁本内酯及干浸膏得率的正交试验结果,联合熵权法计算权重,即:

(1)计算Pij(概率)。

Pij即第j次试验在第i个评价指标下的概率,0≤Pi≤1。

(2)计算Hi(信息熵)。

(3)计算Wi(权重系数)。

得各成分权重分别为阿魏酸0.282 7,绿原酸0.202 6,欧前胡素0.145 6,藁本内酯0.225 8,干浸膏得率0.143 1。综合评分= (Y1/Y1MAX)×0.282 7+(Y2/Y2MAX)×0.202 7+(Y3/Y3MAX)×0.145 6+(Y4/Y4MAX)×0.225 8+(YG/YGMAX)×0.143 1×100。结果见表1,即正交试验结合熵权法优选当归头最优提取工艺为加入当归药材(粉末)质量的10倍量体积提取液,提取3次,每次90min。

2.5 BP-ANN

2.5.1 建立模型 以3层结构BP-ANN构建模型,以提取次数(A)、加液量(B)、提取时间(C)为输入节点数,综合评分为输出节点数[9]。

2.5.2 网络训练及参数 运用MATLAB R2012a软件,构建“2.5.1”项下模型并训练,得3-10-1网络模型。赋值提取次数、加液量、提取时间,以上述模型开展仿真模拟,得网络训练均方差曲线见图2,优化提取工艺参数,回归分析网络预测值和实测值,的两值相关系数r=0.998 64,即网络模型性能良好。

注:A.均方误差图;B.训练回归曲线;C.验证回归曲线;D.总回归曲线。

2.5.3 BP-ANN预测 固定提取次数、加液量、提取时间中任意两因素水平值,并适当改变剩余因素水平值,运用y=sim (net,x)(y为预测值,x为提取次数、加液量、提取时间不同水平值组合)预测,考察最优提取工艺参数。得相应当归头提取工艺为:加入当归药材(粉末)质量的9.6倍量体积提取液,提取3次,每次提取67min。该条件下的综合评分最大为98.86。

2.6 验证试验

平行精密称取6份当归头药粉,每份5g,按正交试验及BP-ANN优化工艺分别开展3批验证试验,得综合评分均值分别为98.37和98.94,见表3;表明以BP-ANN优化工艺提取综合提取率更优,即当归头的最优提取工艺为加入药材(粉末)质量的9.6倍量体积提取液,提取3次,每次提取67min。

表3 BP-ANN、正交试验优化工艺验证结果及对比

3 讨论

3.1 考察指标的选择

文献研究表明,阿魏酸、绿原酸、欧前胡素、藁本内酯等是目前当归研究中出现频次较多的成分[9-11]。同时前期研究发现,当归不同药用部位两两配伍,会引起阿魏酸等的含量及干浸膏得率呈现不同程度的下降。因此,以上述4种化学成分含量和干浸膏得率作为考察指标,既可使当归头提取工艺优化试验的结果更具科学性和精准性,又可满足中药多靶点、多层次、多渠道、整体作用的临床特点。

3.2 研究方法的选择

正交试验设计是分式析因设计的主要方法,既能分析各因素内部不同水平间的差异性,也能分析各因素、水平组合的交互作用,运用有限次数试验从大量因素中找出存在显著意义的因素。但由于正交试验设计中的因素、水平数量与试验次数存在显著的线性关系,因此在解决实际问题过程中较难满足存在非线性关系的相关问题。BP-ANN则可通过对已有数据的训练与学习,构建数学模型以及更加稳定、科学的多因素和水平间关系,促进复杂非线性系统问题的研究,即能有效弥补正交试验设计解决非线性关系问题的不足。两法结合开展相关研究,可使试验结果更具科学性、严谨性,更便于在实际工作中推广应用。