虫草扶正方协同免疫调节作用研究

蒋均才,康小燕,陈 坤,武万兴,汪小东,李 润*,梅全喜

(1.宜昌东阳光长江药业股份有限公司,湖北 宜昌 443300;2.东莞市东阳光冬虫夏草 研发有限公司,广东 东莞 523000;3.深圳市宝安区中医院,广东 深圳 518000)

《素问·刺法论》提出“正气存内,邪不可干”,如果体内正气充沛,外界致病之邪气就不能侵袭机体。正气是人体内部各个系统协调运作、维持身体平衡稳定状态的基础。免疫力则是现代医学的概念,是机体对外界病原体、抗原等异物的识别和排除反应的能力,是人体自身防御机制的一种重要表现。在概念和功能上,中医的“正气”理论与免疫有很多相似之处,正气和免疫力都是机体正常生理功能,共同发挥防御、自稳、监视作用。因此,增强正气,或者增强机体的免疫力,提高机体自我调节能力,以预防疾患发生,维护身心健康[1]。

虫草扶正方由冬虫夏草、西洋参、北沙参、肉桂组成,具有扶正固本,增强机体免疫力,调整机体亚健康状态的作用。方中冬虫夏草与西洋参、北沙参同用,具有补肺益肾、益气养阴的功效,稍佐以肉桂鼓舞正气,增强冬虫夏草培补下元的作用。全方性味平和,阴阳双补,可调和肺、肾等脏腑功能,提高免疫力,增强身体机能。现代研究表明,冬虫夏草、西洋参、北沙参能增强机体免疫功能[2-11],但三者配伍增强免疫力的研究尚未见报道。为此,参考国家市场监督管理总局《保健食品功能评价方法(2020年版)(征求意见稿)》,对以冬虫夏草、西洋参、北沙参、肉桂为原料配伍的虫草扶正方进行免疫力功能试验研究,探讨其机制,为后续产品的开发及临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雄性Balb/c小鼠,体质量18～22g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,实验动物生产许可证号:SCXK(湘)2019-0004,实验动物使用许可证号:SYXK(湘)2015-0016,检疫合格。

1.2 药品与试剂

虫草扶正方组成:冬虫夏草、西洋参、北沙参、肉桂,采用已上市HEC牌冬虫夏草经典复方胶囊,由东莞市东阳光冬虫夏草研发有限公司提供(批号:H0408BU),冬虫夏草粉(批号:BJ20190117)由东莞市东阳光冬虫夏草研发有限公司提供,肉桂(批号:XC20190215)由西安小草植物科技有限责任公司提供,北沙参(批号:DJC13)和西洋参(批号:DED30)由顺天本草股份有限公司提供,药材均符合《中华人民共和国药典》(2020年版)标准[12]。

刀豆蛋白A(批号:C5272-0019)购自Sigma;噻唑蓝(批号:190213)购自上海源叶生物科技有限公司;0.9%氯化钠注射液(批号:A19021103)购自湖南康源制药有限公司;SA缓冲液(批号:S31106)购自北京雷根生物技术有限公司;都氏液(批号:D190417)购自路非凡生物科技有限公司;绵羊血红细胞SRBC(批号:YC-X00106)购自郑州百基生物技术有限公司;CCK-8试剂盒(批号:FK774)购自日本同仁化学;LDH试剂盒(批号:GL19302)购自东仁化学;印度墨汁(批号:P0544-0012)购自广州市齐云生物技术有限公司。

1.3 仪器设备

HERAcell®150i型细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司);ST16型离心机(美国Thermo Fisher公司);DJB系列不锈钢流架(苏州市苏杭科技器材有限公司);SW-CJ型超净操作台(苏州安泰空气技术有限公司);PHERAstarFS型酶标仪(德国BMG LABTECH GMbH公司);ME403E/02型梅特勒天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司)。

2 方法

2.1 试验动物分组及给药方法

2.1.1 虫草扶正方拆方协同免疫调节作用 本实验采用正常小鼠,按照体质量随机分为正常对照组、虫草扶正方组、冬虫夏草+北沙参+肉桂组、冬虫夏草+西洋参+肉桂组、冬虫夏草+西洋参+北沙参组、西洋参+北沙参+肉桂组、冬虫夏草组、西洋参组、北沙参组、肉桂组共10组,每组各10只小鼠。各组小鼠用带有灌胃针头的注射器经口灌胃给药,按照体质量计算给药体积,给药体积为10mL/kg。给药剂量如表1所示,正常对照组给予等体积蒸馏水,每天给药1次,连续给药30天。

表1 动物分组及给药剂量

供试样品按照表2中的比例(质量百分比)进行称量,经粉碎,过80目筛,混合,样品称取适量后分别加入相应体积的蒸馏水超声溶解,配置浓度为30mg/mL。

表2 各试验组分组及原料占比情况 (%)

2.1.2 虫草扶正方不同剂量免疫调节作用 本实验采用正常小鼠,按照体质量随机分为正常对照组、虫草扶正方100mg/kg组、虫草扶正方200mg/kg组、虫草扶正方300mg/kg组、虫草扶正方400mg/kg组,共5组,每组各10只小鼠。4组虫草扶正方的给药剂量分别相当于人体推荐量的10倍、20倍、30倍、40倍。各组小鼠用带有灌胃针头的注射器经口灌胃给药,按照体质量计算给药体积,给药体积为10mL/kg。正常对照组给予等体积蒸馏水,每天给药1次,连续给药30天。

2.2 ConA诱导脾淋巴细胞增殖检测

灌胃给予供试品30天后,用颈椎脱臼法处死小鼠,取脾脏并使用RPMI1640培养基制备单细胞悬液,每一份脾细胞悬液分2孔加入96孔培养板中,每孔100μL。一孔加10μg/mL的刀豆蛋白A液(ConA液)10μL,另一孔加入等量PBS作为对照。置于37℃、5% CO2培养箱中培养48h。培养结束后,每孔加CCK8液,再继续培养4h后进行检测。每孔做3个平行孔,用酶标仪在570nm波长处测定OD值。脾淋巴细胞的增殖能力用ConA的OD值减去不加ConA的OD值表示。供试样品组的OD差值显著高于对照组的OD值,可判定该项实验结果阳性。

2.3 小鼠碳廓清能力检测

连续灌胃给予供试品30天后,通过尾静脉注射生理盐水稀释4倍的印度墨汁,注射量按10mL/kg体质量计算。在注射后2min、10min从内眦静脉丛取血20μL,加入到2mL 0.1 % Na2CO3溶液中,用酶标仪在600nm波长处测定OD值,并将小鼠处死,取肝脏、脾脏称质量,计算吞噬指数,以表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a,受试样品的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数,可判定该项实验结果阳性。

2.4 NK细胞活性测定

灌胃给予供试品30天后,用颈椎脱臼法处死小鼠,取小鼠脾脏制备单细胞悬液,按乳酸脱氢酶测定法进行实验,用酶标仪在490nm处测定OD值,计算NK细胞活性。按下式计算NK细胞活性,供试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性,即可判定该项实验结果阳性。

NK细胞活性(%)=

2.5 血清溶血素试验

各组小鼠按10mL/kg灌胃给予相应供试样品或蒸馏水,1次/天,连续30天。实验结束前第5天,每只小鼠腹腔注射0.2mL 2%(v/v)SRBC进行免疫。末次给样1h后,摘眼球取血,收集血清用0.9%氯化钠注射液稀释,收集血清用0.9%氯化钠注射液稀释,按标准规定检测半数溶血值(HC50)。供试样品各剂量组与正常对照组进行比较,供试样品组的HC50显著高于对照组,可判定该项实验结果阳性。

2.6 统计学分析

3 结果与分析

3.1 虫草扶正方拆方协同免疫调节作用

3.1.1 对小鼠体质量的影响 实验过程中,所有小鼠活动良好,皮毛光滑,饮食和饮水正常,无精神不振情况,虫草扶正方组及各不同配伍组与正常对照组的比较,小鼠的体质量差异无统计学意义(P>0.05),见表3所示。

表3 各组受试物对小鼠体质量的影响

3.1.2 小鼠脾淋巴细胞转化试验 如表4所示,与正常对照组相比,虫草扶正方组、冬虫夏草+北沙参+肉桂组及冬虫夏草+西洋参+北沙参组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性在ConA诱导下显著增加(P<0.01),而其他组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 虫草扶正方及不同配伍对小鼠免疫功能的影响

3.1.3 小鼠碳廓清能力试验 如表4所示,与正常对照组相比,虫草扶正方组小鼠的巨噬细胞吞噬指数显著升高(P<0.01),冬虫夏草+西洋参+北沙参组及冬虫夏草组小鼠的巨噬细胞吞噬指数显著升高(P<0.05),而其他组别小鼠的吞噬指数无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。

3.1.4 NK细胞活性测定 如表4所示,与正常对照组相比,虫草扶正方组、冬虫夏草+西洋参+北沙参组及冬虫夏草组小鼠的NK细胞杀伤活性显著增加(P<0.01),而其他组小鼠的NK细胞较正常对照组相比无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。

表4的实验结果表明,与正常对照组相比,虫草扶正方组(冬虫夏草+西洋参+北沙参+肉桂)、冬虫夏草+西洋参+北沙参组小鼠的脾淋巴细胞ConA诱导下增殖能力、巨噬细胞吞噬功能及NK细胞杀伤活性均显著增强(P<0.01或P<0.05),冬虫夏草组小鼠的巨噬细胞吞噬功能及NK细胞杀伤活性均显著增强(P<0.01或P<0.05)。根据《保健食品功能评价方法(2020年版)(征求意见稿)》中增强免疫力指导原则,这3组受试样品均具有增强免疫力作用,其中,虫草扶正方组的效果要优于冬虫夏草+西洋参+北沙参组,冬虫夏草+西洋参+北沙参组的效果优于冬虫夏草组。与正常对照组相比,冬虫夏草+北沙参+肉桂组小鼠的脾淋巴细胞ConA诱导下增殖能力显著增强(P<0.01),巨噬细胞吞噬指数及NK细胞活性均无明显变化。与正常对照组相比,其他5组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力、巨噬细胞吞噬指数及NK细胞活性均无明显变化。

3.2 虫草扶正方不同剂量免疫调节作用

3.2.1 对小鼠体质量的影响 实验过程中,所有小鼠活动良好,皮毛光滑,饮食和饮水正常,无精神不振情况,虫草扶正方组及各对比例组小鼠的体质量与正常对照组的比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表5所示。

表5 各组受试物对小鼠体质量的影响

3.2.2 小鼠脾淋巴细胞转化试验 当淋巴细胞受ConA刺激后淋巴母细胞发生增殖反应,淋巴细胞数目增加。CCK8检测ConA刺激后淋巴细胞增殖细胞数量即可反映出淋巴细胞受抗原刺激后机体的免疫力强弱。如表6所示,与正常对照组相比,虫草扶正方1组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力增强(P<0.05),虫草扶正方2组、3组和4组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力显著增强(P<0.01),判定虫草扶正方各剂量组实验结果均为阳性。

表6 虫草扶正方各剂量组对小鼠免疫功能的影响

3.2.3 小鼠碳廓清能力试验 巨噬细胞的吞噬功能是衡量机体非特异性免疫功能的一项重要指标,当小鼠尾静脉注射墨汁后,外周血中的巨噬细胞会吞噬异物颗粒,检测巨噬细胞的吞噬指数a的大小能够反映出机体巨噬细胞吞噬功能的高低。如表6所示,与正常对照组相比,虫草扶正方2组和虫草扶正方4组小鼠的吞噬指数显著升高(P<0.05),虫草扶正方3组小鼠的单核-巨噬细胞吞噬指数显著升高(P<0.01),而虫草扶正方1组单核-巨噬细胞吞噬能力与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),判定虫草扶正方2组、3组、4组实验结果为阳性,虫草扶正方1组实验结果为阴性。

3.2.4 NK细胞活性测定 NK细胞是一类具有杀伤作用的天然免疫细胞群,NK细胞杀伤活性是机体非特异性免疫功能的一项重要指标。NK细胞与靶细胞共同培养条件下,靶细胞被NK细胞杀伤,并释放出LDH(乳酸脱氢酶)到细胞外。因此用LDH细胞毒试剂盒检测LDH释放量即可反映出NK细胞的杀伤活性,进而反应机体免疫功能。如表6所示,与正常对照组相比虫草扶正方3组NK细胞杀伤活性极显著增强(P<0.01),而虫草扶正方1组、2组和4组NK细胞杀伤活性与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),判定虫草扶正方3组实验结果为阳性,虫草扶正方1组、2组和4组实验结果为阴性。

3.2.5 血清溶血素试验 用绵羊红细胞免疫小鼠,可引发小鼠血清中的特异性抗绵羊红细胞抗体的产生,该抗体是一种溶血素,能够溶解绵羊红细胞。如表6所示,与正常对照组相比,虫草扶正方各剂量组半数溶血值无显著性差异(P>0.05)。

虫草扶正方由冬虫夏草、西洋参、北沙参、肉桂组成,本试验从细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性等方面研究虫草扶正方的免疫调节功能。根据《保健食品功能评价方法(2020年版)(征求意见稿)》中增强免疫力指导原则,在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面中任两个方面结果阳性,可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。表6实验结果显示,与正常对照组相比,虫草扶正方剂量2组、3组、4组均具有增强机体免疫力的功能,其中最低有效作用剂量为200mg/kg。

4 结果与讨论

研究结果表明,组成虫草扶正方的各味药材间(冬虫夏草、西洋参、北沙参、肉桂)存在免疫协同作用,在同等剂量条件下复方的免疫协调作用明显优于单味药材或部分药材组合;且虫草扶正方在不同剂量条件下(200、300、400mg/kg)具有脾淋巴细胞转化活性、NK细胞杀伤活性和巨噬细胞吞噬活性,根据《保健食品功能评价方法(2020年版)(征求意见稿)》评价标准判定:虫草扶正方具有增强免疫力的作用。

据文献报道,冬虫夏草、西洋参及北沙参具有增强免疫力的功能[2-11],其中冬虫夏草增强免疫力的最低有效作用剂量为200mg/kg[13],西洋参增强免疫力的最低有效作用剂量为550mg/kg[14-15],北沙参增强免疫力的最低有效作用剂量为2 000mg/kg[16],而肉桂未见有增强免疫力方面的报道。虫草扶正方不同剂量实验中,虫草扶正方增强免疫力的最低有效作用剂量为200mg/kg,整体配方最低有效作用剂量远远低于文献报道中西洋参及北沙参等单味药材的最低有效作用剂量,说明虫草扶正方各味药材具有协同免疫的作用。

在虫草扶正方拆方配伍协同作用试验中,同等剂量(300mg/kg)条件下,与正常对照组相比,冬虫夏草组具有增强免疫力的作用,冬虫夏草组的试验结果与文献报道吻合,西洋参及北沙参组由于供试样品剂量未达到最低起效剂量,故未体现出提高免疫力的效果。与正常对照组相比,冬虫夏草+西洋参+北沙参组具有明显的增强免疫力的作用,冬虫夏草+北沙参+肉桂组、冬虫夏草+西洋参+肉桂组及西洋参+北沙参+肉桂组未体现增强免疫力的作用,说明冬虫夏草、西洋参、北沙参三者的合理配比具有提高免疫力的效果,其他三味药材的组合未体现明显效果。与正常对照组相比,虫草扶正方组(冬虫夏草+西洋参+北沙参+肉桂)、冬虫夏草+西洋参+北沙参组具有明显的增强免疫力的作用,且虫草扶正方组的效果优于冬虫夏草+西洋参+北沙参组,说明添加肉桂强化了冬虫夏草、西洋参、北沙参的提高免疫力的效果,进一步说明冬虫夏草、西洋参、北沙参及肉桂具有协同提高免疫力的作用。

虫草扶正方组将冬虫夏草、西洋参、北沙参合理配伍,加强整体配方增强免疫力的功能。本研究证明虫草扶正方能够促进机体的免疫功能且具有协同作用,但未深入探究虫草扶正方增强免疫功能的分子作用机制,有必要在今后对其作用机制及其他功效作进一步探讨,从而为此类复合物的应用研究提供更全面的参考信息。