发酵茶酒微生物多样性、品质特性及抗氧化作用分析

陈向阳，王 浩，王梓菲，万志兵,2，胡长玉

（1.黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041；2.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016）

夏秋茶是指夏秋季节采摘加工的茶叶，其产量很高，占全年的60%以上。夏秋茶的苦涩味较重，鲜爽味、品质较低，目前夏秋茶在经过修剪之后往往作为肥料留在茶园当中，利用率极其低下[1]。然而夏秋茶富含茶多酚、咖啡碱类、茶多糖等生物活性物质[2]，具有预防心血管疾病、修复化学性肝损伤、增加机体免疫和抗皮肤衰老等作用[3，4]。因此，充分开发与利用夏秋茶，将对提高夏秋茶附加价值、促进茶产业的发展、增加茶农收入具有重要的现实意义。

茶酒是以茶叶为主要原料，经直接浸提、配制或生物发酵制作出具有茶的清香与酒的醇柔的一类饮用酒的统称[5]。目前，茶酒制作的主要类型为配制型茶酒和发酵型茶酒，将夏秋茶与高粱、大米、小麦等酿酒原材料进行混合，经蒸馏制成的发酵茶酒的研究还鲜有报道。鉴于此，本研究将夏秋茶与酿酒原料进行混合固体发酵，运用高通量测序技术对发酵茶酒酒醅的微生物群落结构构成进行分析，并对成品酒基本理化组成、茶多酚含量及香气物质进行分析，且对发酵茶酒的抗氧化功效进行评价，旨在为准确认识发酵茶酒的微生物群落结构组成及发酵品质提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

夏秋茶（屯溪绿茶）购于安徽省黄山市休宁县荣山茶厂；硫酸标准滴定溶液（国家二级标准物质），上海市计量测试研究院；DPPH 和ABTS：美国sigma 公司；七水合硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等：西陇科学股份有限公司；其它所用试剂均为国产，购于南京化学试剂有限公司。

TU-1810 型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；ME 55 电子天平上海梅特勒-托利多仪器有限公公司；SCQ-8201恒温水浴锅：上海声彦超声波仪器有限公司；TGL-16A 台式高速冷冻离心机：湖南平科科学仪器有限公司；Spectra-Max-190 型全波长酶标仪：美国MolecuLar Devices公司；HP7890A/5975C 气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶酒发酵工艺流程及操作要点

茶酒发酵工艺流程如图1所示。

图1 茶酒发酵工艺流程图

图1 所示工艺流程：夏秋茶和原粮（拌匀）→接种酒曲→入窖、密封发酵60 天→出窖→蒸酒→成品。操作要点：取夏秋茶30kg 与高粱300kg、大米150kg、小米50kg 混匀，接种酒曲（酒曲和稻糠的量为总重的30%）并搅拌均匀，入窖池，保持窖池温度为30℃、湿度为70%～80%，发酵60 天后蒸馏，按照采用掐头去尾的方法摘酒，得发酵成品茶酒，密封避光储存[6]。同时设立对照组，为未添加茶叶进行固体发酵制得的白酒。

1.2.2 DNA提取及测序

采集发酵60天的茶酒酒醅，运用试剂盒提取微生物宏基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取结果，用NanoDrop2000检测浓度和纯度。参考吴永祥等[7]，使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对细菌16S rDNA基因V3～V4区域扩增；使用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）对真菌ITS区域扩增。PCR扩增及高通量测序工作委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。

1.2.3 成品茶酒的理化指标测定

1.2.3.1 感官分析

参照国家标准白酒感官品评术语的方法（GB/T33405-2016），由7 名经过专业训练食品专业人员通过色泽、外观、香气和口味等方面进行评定。

1.2.3.2 pH、酒精度和总酸含量的测定

pH 值采用pH 测定仪测定，具体操作步骤见说明书；酒精度的测定参照食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定的标准和方法（GB5009.225-2016）；总酸、总酯含量的测定参照食品安全国家标准白酒分析方法的标准和方法（GB10345-2022）。

1.2.3.3 茶多酚含量的测定

参照国家标准的酒石酸亚铁比色法（GB/T21733-2008）。

1.2.4 发酵茶酒挥发性成分分析

对王晓娜等人[8]的方法加以改进，取样品5mL于固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2cm、50/30μm DVB/CAR/PDMS Stableflex 纤维头的手动进样器，在60℃条件下萃取35min，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口，热解析5min进样。

气相色谱条件:色谱柱HP-5MS（50m×0.25mm×0.20μm）；升温程序为：初始温度40℃，保持5min，以4℃·min-1升温至200℃，保持10min，进样口温度250℃；以氦气（纯度99.99%）为载气,流速1mL·min-1，不分流进样。MS 条件：离子源为电子电离源（EI）；离子源温度200℃；转接口温度200℃；扫描范围为50～550Amu。

总离子色谱图积分得到的各组分在NIST17 质谱库中进行检索，筛选出匹配度≥85%的化合物，对各个化合物进行定性，同时利用面积归一法计算各个香气成分的相对含量。

1.2.5 发酵茶酒的抗氧化能力测定

ABTS 自由基清除基清除能力的测定参考文献[9]；DPPH 自由基清除基清除能力的测定参考文献[10]；超氧阴离子自由基清除基清除能力的测定参考文献[11]。测定时以未添加茶叶进行固体发酵制得的白酒作为对照组。

1.3 数据处理

所有实验重复3 次，数据用xˉ±s表示。采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 发酵茶酒酒醅的细菌多样性分析

在属水平上发酵茶酒酒醅的细菌菌群丰度如图2 所示。在发酵60d 的茶酒成熟酒醅中乳杆菌属（Lactobacillus）和克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）为主要优势菌群，相对丰度分别为88.68%、10.51%，与之前诸多报道一致[12，13]。这可能由于在茶酒酒醅发酵初始阶段，多种微生物共同分解利用有机物，随发酵时间延长，窖池内部酸、醇含量升高抑制了绝大多数不耐酸类微生物的生长，池内氧含量降低，微生态由复杂的多菌属生态结构演替为单一的乳酸杆菌属（Lactobacillus）为主导的生态结构[12]。

图2 属水平上的发酵茶酒酒醅的细菌丰度分析

2.2 发酵茶酒酒醅的真菌多样性分析

在属水平上发酵茶酒酒醅的真菌菌群丰度如图3 所示。出窖成熟酒醅的真菌微生物多样性较为丰富，主要由Cutaneotrichosporon、unclassified-f-Dipodascaceae、复膜胞酵母属（Saccharomycopsis）、Geotrichum、双足囊菌属（Dipodascus）、伊萨酵母属（Issatchenkia）、曲霉属（Aspergillus）、红酵母菌属（RhodotoruLa）、哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）、镰孢霉属（Fusarium）组成。优势菌群为Cutaneotrichosporon、Saccharomycopsis、Geotrichum，相对丰富分别为21.23%、13.77%、9.92%，在茶酒发酵过程中能分泌多种有利于淀粉糖化以及蛋白质分解的酶类，如淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，促进茶酒发酵的形成[14]。本研究结果与大多数浓香型白酒所展现的真菌菌群组成略有不同[15，16]，可能与添加茶叶发酵，影响部分微生物的生长，致使真菌菌群结构组成发生改变。

图3 属水平上的发酵茶酒真菌丰度分析

2.3 发酵茶酒的理化性质分析

由表1可以看出，发酵茶酒在香气、口味与一般白酒（对照组）均存在差异。发酵茶酒茶香凸显，具有茶酒的独特风味。依据GB/T10781.1-2021《浓香型白酒》及其明示指标，可得出发酵茶酒的pH、酒精度、总酸和总酯含量均符合该标准，在酒精、总酸和总酯等指标上达到了高度酒优级的标准。相比于对照组，发酵茶酒中检测出茶多酚，其含量为14.8±1.31mg·kg-1。有研究表明以茶多酚为主体的茶特征成分与茶酒在抗氧化活性上具有协调增效作用[17]。

表1 发酵茶酒的理化性质

2.4 发酵茶酒的挥发性成分分析

发酵茶酒的主要成分及相对含量如表2所示。

表2 发酵茶酒主要成分及相对含量

由表2 可得，利用HS-SPME/GC-MS 方法检测到发酵茶酒与对照组的挥发性成分种类差异较大。对照组共鉴定得到53种化合物，其相对含量占挥发性成分总量的96.56%，分为醇类8 种（82.05%）、酯类22种（12.3%）、醛酮类4种（0.62%）、有机酸类9种（1.45%）、烷烃类8 种（0.11%）、呋喃类1 种（0.01%）、烯类1 种（0.02%）；发酵茶酒中共鉴定出30 种挥发物，其相对含量占挥发性成分总量的96.93%，分为醇类5种（86.03%）、酯类12种（10.33%）、醛酮类2种（0.19%）、有机酸类4 种（0.17%）、烷烃类7 种（0.21%）。

醇类是发酵茶酒挥发性成分的第一主要成分，主要为乙醇、异戊醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇等化合物。发酵茶酒中醇类化合物主要是通过糖酵解的途径产生，同时氨基酸在厌氧条件下可以通过埃里希代谢途径形成高级醇[8,18]。酯类是发酵茶酒挥发性成分的第二主要成分，主要为棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、十四酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯等，呈现出茶酒特殊的水果香味、花香味。结果表明，发酵茶酒和一般白酒的醇类、酯类等主要挥发性成分含量上相差不大，然而发酵茶酒中的棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、硬脂酸乙酯、全顺式9,12,15-十八碳三烯酸乙酯、癸酸乙酯等酯类成分有所提高，说明发酵茶酒的主要挥发性成分是来自于酿酒过程，茶组织带来的香气成分对发酵茶酒整体香气有一定的贡献[17]。发酵茶酒特定的生产工艺导致了发酵茶酒酒醅中独特性的微生物组成和动态变化，物质代谢、能量代谢的结果也有所差异，是茶酒独特风味形成的主要因素[13]。

2.5 发酵茶酒的抗氧化作用分析

发酵茶酒的抗氧化作用如图4所示。

图4 发酵茶酒的抗氧化作用

由图4 可知，发酵茶酒的ABTS、DPPH 以及超氧阴离子自由基清除能力较对照组均有较大程度的提高，其中发酵茶酒的自由基清除率分别为（99.76±0.06）%、（57.01±0.49）%、（48.20±2.35）%，而对照组的自由基清除率仅为（8.63±1.26）%、（23.55±2.71）%、（24.36±1.34）%。结果表明，发酵茶酒的抗氧化能力高于一般白酒。茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，主要包括儿茶素类、黄酮类、花青素类等物质，具有酚羟基、醇羟基等多个反应活性基团，具有抗氧化和抑菌等多种作用，可用于延长产品货架期、改善产品口感等[19]。相比于对照组未添加茶叶酿造的白酒，发酵茶酒中检测出较高含量的茶多酚，呈现出显著的自由基清除能力、较强的体外抗氧化活性。

3 结 论

本研究结果表明，发酵茶酒酒醅的优势微生物为乳杆菌属、Cutaneotrichosporon、复膜胞酵母属和Geotrichum。发酵茶酒的pH、酒精度、总酸等理化指标均符合国家标准。发酵茶酒的挥发性成分主要为醇类、酯类、醛酮类和有机酸等，具有茶酒独特的特性。对比未添加茶叶酿造白酒，发酵茶酒具有更显著的ABTS、DPPH以及超氧阴离子自由基清除效果，这与发酵茶酒中富含茶多酚等多种抗氧化成分有关。本研究揭示了发酵茶酒酒醅的微生物菌群组成，对比分析了茶酒的基本理化组成、挥发性成分和抗氧化作用，为夏秋茶综合利用及茶酒开发提供参考。