不同含水量蒙古栎种子贮藏过程生理生化特性研究

魏 俊，梁新茗，曲悦慈，梅 梅，王玉涛，陆秀君

（沈阳农业大学林学院，沈阳 110161）

蒙古栎（Quercus mongolica）为我国二级珍贵树种[1]，属壳斗科（Fagaceae）栎属（QuercusL.）植物，广泛分布于中国东北、内蒙古和华北地区，是中国栎类植物中分布最北、最抗寒和抗旱树种[2]。蒙古栎种子俗称橡实，含丰富的淀粉、蛋白质和油脂，为优良木本淀粉能源来源，发展潜力十分巨大[3]。然而，蒙古栎种子采收后初始含水量高，不耐贮藏[4]。种子耐藏性与种子活力密切相关，耐藏性高的种子贮藏后活力水平较高[5]，提高种子耐藏性可为农林生产提供高产潜力种子。由于遗传背景、种子发育以及贮藏条件等多种内外因素存在差异，不同种子贮藏寿命差异巨大。对于顽拗性种子，因其种子成熟后含水量高，不耐脱水和低温，种子贮藏困难，经过一定时间贮藏后，种子活力低下。蒙古栎种子属顽拗性种子，贮藏过程中极易萌发或腐烂[6]。在中国北方地区育苗生产中，蒙古栎常采用秋播方式避免种子贮藏。然而，探究蒙古栎种子适宜贮藏条件，提高种子耐藏性，对蒙古栎相关理论研究及产业应用十分重要。

研究表明，低温能有效提高栎类植物种子耐藏性。栓皮栎（Quercus variabilis）种子在低温贮藏条件可保持较高种子活力[7]，而青冈栎（Cyclobalanopsis glauca）种子在低温条件下可有效减缓淀粉分解从而延长种子贮藏时间[9]。在高温高含水量条件下，弗吉尼亚栎（Quercus virginiana）种子贮藏极易发生霉变，丧失活力[8]。除低温外，适度脱水对顽拗性种子的贮藏也具有显著效果[10]。栓皮栎种子最适贮藏含水量为48%~50%，降低种子含水量可有效减缓内源物质变化，但为确保种子活力，种子含水量必须大于28.20%[7]。辽东栎（Quercus wutaishansea）种子贮藏过程中活力变化与种子含水量呈显著正相关[11]，适度脱水可有效提高种子耐藏性[12]。

目前，虽有诸多关于栎类植物种子贮藏相关研究被报道，但蒙古栎相关研究较少。蒙古栎种子初始含水量高，贮藏困难，其贮藏过程中种子活力与内源物质变化及其两者相互关系仍不清楚。本研究试图通过降低蒙古栎种子初始含水量，鉴定不同贮藏温度下种子活力和内部生理生化变化，以期探究蒙古栎种子最适贮藏条件，为提高蒙古栎种子耐藏性提供理论和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2020 年9 月蒙古栎种子采自辽宁省抚顺市清原县优良蒙古栎天然林分。具体采种方法为：在蒙古栎种子大量脱落期，于地面收集饱满、无虫蛀和机械损伤的完好种子。

1.2 方法

将新采收的蒙古栎种子混合均匀，使用敌敌畏和氧化乐果（1∶1）混合试剂进行喷洒消毒。种子经24 h 密封消毒后，用清水冲洗掉残余消毒液，摊开阴干表面水分备用。选择大小均一、外观良好的蒙古栎种子，在室温条件下采用硅胶干燥法，分别使种子含水量快速降低到40%，30%，20%，同时以未脱水处理的种子（采后初始含水量为50%）为对照。

将不同含水量蒙古栎种子分别置于低温（4 ℃）和室温（20 ℃）条件下贮藏。种子采用2层聚乙烯塑料袋密封包装。为测定种子贮藏过程生理生化和种子活力变化，每隔14 d取样1次，直至种子活力完全丧失。

1.2.1 种子活力检测 通过对不同贮藏时间蒙古栎种子进行萌发试验来反映种子活力。在透气陶瓷花盆中，将45粒种子与湿沙混合，置于25 ℃条件下，采用自然光照及光周期进行萌发试验，每样本3次生物学重复。种子萌发以胚根突破种皮达种子总长1/2以上为标准。萌发试验每隔5 d记录1次萌发粒数并适时补水。

1.2.2 种子生理指标测定 种子可溶性糖和淀粉含量测定采用蒽酮比色法，可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法，丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法，游离脯氨酸含量测定采用黄基水杨酸法[13]。各样品测定设置3次生物学重复。

1.3 数据处理方法

采用Excel 2016和Spss 22.0进行数据处理。双因素方差分析使用Two-way法，多重比较使用Student-Newman-Keuls进行检验。图表绘制使用Origin 2018进行。

2 结果与分析

2.1 不同含水量及贮藏温度对蒙古栎种子耐藏性的影响

新采收的蒙古栎种子萌发率可达100%，经硅胶脱水处理后，不同含水量种子萌发率与新收获种子无显著差异。室温贮藏后，蒙古栎种子萌发率随初始含水量下降而下降，贮藏56 d后，不同含水量种子的萌发率均未达到贮藏前萌发率的30%。室温贮藏70 d后，所有种子活力基本丧失。初始含水量为20%的种子室温贮藏28 d后萌发率只有20.70%，而初始含水量为30%的种子贮藏28 d后萌发率仍可达40.00%，且后续贮藏过程中，种子活力丧失缓慢，贮藏56 d后仍可维持30.10%的萌发率。初始含水量为40%的种子与对照相比在室温贮藏条件下耐藏性近同，室温贮藏42 d后种子萌发率急剧下降（表1）。

表1 不同贮藏条件下蒙古栎种子萌发率Table 1 Seed germination rate of Q. mongolica under different storage conditions

低温贮藏过程中，除初始含水量为20%的种子萌发率呈直线下降趋势外，其余不同含水量种子萌发率下降缓慢，且较室温贮藏种子活力更高。其中，初始含水量为30%和40%的种子低温贮藏后种子活力无显著差异，且优于对照。初始含水量为20%的种子在低温贮藏42 d后种子萌发率低于贮藏前的30%，56 d后基本丧失活力。初始含水量为30%的种子在低温贮藏70 d 后种子萌发率仍达41.70%，为贮藏前的42.46%。此外，初始含水量为40%的种子在低温贮藏84 d后种子萌发率仍可达45.45%，为贮藏前的45.77%（表1）。

2.2 不同贮藏条件下蒙古栎种子生理生化变化

2.2.1 不同贮藏条件下蒙古栎种子可溶性糖含量变化 不同含水量蒙古栎种子在贮藏期间可溶性糖含量均呈先上升后波动下降趋势。降低其初始含水量对种子原有可溶性糖含量无显著影响。初始含水量相同的蒙古栎种子在低温贮藏条件下可溶性糖含量显著高于室温贮藏。在低温和室温贮藏条件下，初始含水量为20%的种子分别在贮藏28 d和14 d达到峰值，而后可溶性糖含量逐渐下降。对于初始含水量为30%的种子，可溶性糖含量在贮藏56 d达到最大值，70 d后显著下降。未经过脱水处理的种子在贮藏14 d后可溶性糖含量达到峰值，而后逐渐下降。初始含水量为40%的种子在整个贮藏期间可溶性糖含量整体高于其他处理（图1）。

图1 不同含水量蒙古栎种子贮藏过程中可溶性糖含量变化Figure 1 Changes of soluble sugar content in seeds of Q. mongolica with different water content during storage

2.2.2 不同贮藏条件下蒙古栎种子淀粉含量变化 种子含水量对蒙古栎种子淀粉含量的变化整体影响较小。未经过脱水处理的种子在贮藏42 d后淀粉含量开始迅速下降，而其余不同脱水处理的种子在贮藏56 d后淀粉含量才开始下降。低温条件下，初始含水量为20%的种子，在贮藏42 d时淀粉含量大幅度下降，而初始含水量为30%和40%的种子，在贮藏70 d时才出现此现象，各处理种子均与对照具有显著差异。室温条件下贮藏的蒙古栎种子淀粉含量整体低于低温贮藏（图2）。

图2 不同含水量的蒙古栎种子贮藏过程中淀粉含量变化Figure 2 Changes of starch content in seeds of Q. mongolica with different water content during storage

2.2.3 不同贮藏条件下蒙古栎种子可溶性蛋白含量变化 室温条件下，在贮藏14~28 d期间，各处理种子可溶性蛋白含量升高，且增加幅度显著高于对照；贮藏42 d后，初始含水量低的种子可溶性蛋白含量显著高于对照。低温贮藏条件下，各处理种子的可溶性蛋白含量均低于室温贮藏。随着贮藏时间的增加，未经过脱水处理的种子可溶性蛋白含量持续降低，而初始含水量为30%和40%的种子变化规律与之相反，可溶性蛋白含量逐渐升高（图3）。

图3 不同含水量的蒙古栎种子贮藏过程中可溶性蛋白含量变化Figure 3 Changes of soluble protein content in seeds of Q. mongolica with different water content during storage

2.2.4 不同贮藏条件下蒙古栎种子MDA与脯氨酸含量变化 MDA能够衡量组织细胞受氧化胁迫程度，而脯氨酸与植物抗逆性密切相关。蒙古栎种子贮藏过程中，随着贮藏时间增加，不同含水量蒙古栎种子MDA含量都呈升高的趋势，各处理之间具有显著差异。经过脱水处理的种子MDA含量始终显著低于对照，其中初始含水量为30%和40%的种子之间无显著差异。室温贮藏条件下，种子MDA含量变化区间为0.56~4.62 μmol·mL-1，其中初始含水量为30%的种子MDA含量始终处于较低水平，20%含水量的种子MDA增长量最大。初始含水量相同的蒙古栎种子在低温贮藏条件下MDA含量显著低于室温贮藏。在整个贮藏期间，种子的MDA含量变化呈现“双峰型”曲线，分别在28 d和70 d达到峰值（图4）。

图4 不同含水量的蒙古栎种子贮藏过程中MDA含量变化Figure 4 Changes of MDA content in seeds of Q. mongolica with the same water content during storage

在两种贮藏温度下，蒙古栎种子的游离脯氨酸含量变化呈“升-降-升”的趋势，初始含水量越低，游离脯氨酸含量越高。室温贮藏条件下，蒙古栎种子游离脯氨酸含量最高可达122.777 μg·g-1，贮藏28 d后，初始含水量为30%的种子游离脯氨酸含量显著高于其他处理。初始含水量相同的蒙古栎种子在低温贮藏条件下游离脯氨酸含量显著低于室温贮藏。低温贮藏条件下，种子游离脯氨酸含量最高为100.127 μg·g-1。在整个贮藏期间，初始含水量为30%的种子游离脯氨酸含量整体差异较大，贮藏前42 d内显著高于其他处理，贮藏56 d时达到最低值，而后又急剧增加。含水量为40%的种子变化趋势与对照相近，在整个贮藏期间游离脯氨酸含量变化较小（表2）。

表2 蒙古栎种子贮藏过程中游离脯氨酸含量变化Table 2 Changes of free proline content in Q. mongolica seeds during storage

2.2.5 种子初始含水量和贮藏时间对蒙古栎种子各生理指标影响 双因素方差分析表明（表3），在不同贮藏温度下，种子初始含水量和不同贮藏时间对蒙古栎种子可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量具有极显著交互作用，对MDA含量具有显著交互作用。室温贮藏条件下，蒙古栎种子初始含水量和不同贮藏时间对种子淀粉含量变化交互作用不显著（表3）。

表3 初始含水量和贮藏时间对蒙古栎种子贮藏效果影响的双因素方差分析Table 3 Two-factor variance analysis of effects of initial water content and storage time on seed storage of Q. mongolica

3 讨论与结论

种子贮藏密切影响种子活力，而温度和湿度是种子贮藏两个最为关键因素[14]。过高的温度和湿度易导致种子发霉劣变[15]，然而，顽拗性种子又对低温和脱水敏感[16]。因此，对于顽拗性种子，适宜的含水量与贮藏温度是提高种子耐藏性的关键。本研究表明，蒙古栎种子于4 ℃贮藏显著优于20 ℃贮藏，且当种子含水量为30%~40%时，种子活力在贮藏过程中能够较好保存（表1）。

种子贮藏过程中，不同含水量种子内部非结构性碳水化合物差异巨大。蒙古黄芪（Astragalus mongholicus Bunge）种子在贮藏过程中，其可溶性糖含量在贮藏前6 个月呈上升趋势，而后开始下降[17]，这可能与物种自身渗透调节不同有关。初始含水量为3.27%~5.43%的西洋参（Panax quiquefoliumL.）种子，其可溶性糖含量在贮藏过程中呈直线下降趋势，而8.44%含水量的西洋参种子，其可溶性糖含量先下降再上升[18]。本研究表明，在20 ℃和4 ℃贮藏条件下，蒙古栎种子的可溶性糖含量均呈先上升后下降趋势，可溶性糖在贮藏前期不断积累（图1）。这可能与不同阶段种子呼吸不同有关，研究表明，种子贮藏过程，温度和湿度可对种子呼吸产生影响[19]。在种子贮藏期间，呼吸作用是最主要的生理活动，淀粉作为营养物质的供给，通过低温抑制淀粉酶降解，从而限制淀粉代谢对种子萌发的影响[20]。种子的呼吸速率在萌发之前较缓慢，可溶性糖没有被呼吸作用消耗掉，导致淀粉含量逐渐增多，在进入萌发阶段后呼吸作用显著增强，呼吸作用会利用可溶性糖[21]，由于蒙古栎种子对可溶性糖的利用量增加，可溶性糖含量迅速降低。

在种子贮藏过程中，当淀粉合成和积累超过水解和消耗时，会呈现增加趋势，但当种子老化损伤较严重时，淀粉的合成就会受阻。而为了维持细胞呼吸，种子淀粉水解作用加强，致使淀粉含量降低。金小雯考察燕麦（Avena sativaL.）时研究发现，淀粉与种子活力呈极显著正相关，燕麦淀粉含量随贮藏时间延长呈先升高后降低的趋势，并且耐贮性强的品种，其淀粉含量达到峰值所需的时间更长，淀粉含量开始下降的时间较晚[22]。刘丽丽[23]发现枇杷（Eriobotrya japonica）种子在贮藏过程前期淀粉含量上升，在达到峰值后下降，总体呈先升高后降低的趋势。龙金飞等[24]研究发现，沙芥（Pugionium cornutum）种子淀粉含量在贮藏前3 年呈上升趋势，在4~10 年内呈下降趋势，淀粉含量随贮藏年限的增加变化范围为1.34%~2.14%。张海娇等[25]对玉米（Zea maysL.）种子超干贮藏研究发现淀粉含量随老化时间的延长呈下降趋势，含水量为8%的玉米在老化11 d 时淀粉含量由最初的616 g·kg-1降为12 g·kg-1。随着贮藏时间的增加，种子老化程度加深，可溶性糖等物质进行渗透调节以适应老化，细胞呼吸等生理活动需要可溶性糖等物质提供能量，并消耗淀粉等大分子物质进行补充，导致种子淀粉含量呈下降趋势。

种子贮藏过程中，MDA 等有害物质持续积累，从而引发细胞膜脂过氧化并造成膜系统损伤[26]。蒙古栎种子在贮藏期间游离脯氨酸和MDA 含量普遍上升，这一结果与棕榈（Trachycarpus fortunei）[27]、水稻（Oryza sativaL.）[28]和蒲葵（Livistona chinensis）[29]等树种相同。本研究中，在低温条件下贮藏的蒙古栎种子MDA 含量与贮藏时间呈正相关关系，且显著低于室温贮藏，这也与枫香（Liquidambar formosana）[30]、杉木（Cunninghamia lanceolata）[31]、桢楠（Phoebe zhennan）[32]等种子相同，说明低温能减缓MDA 等有害物质快速积累。青冈栎种子贮藏期间MDA 含量与种子初始含水量呈负相关关系[33]；红松（Pinus koraiensis）种子含水量降低至4.2%时种子MDA 含量显著低于高含水量种子[34]；4.3%含水量胡杨（Populus euphratica）种子贮藏过程中MDA 增加幅度远小于高含水量种子[35]。本研究中，蒙古栎种子在贮藏过程中MDA含量变化整体呈上升趋势，但脱水处理的种子，MDA增加幅度显著小于对照（图4）。对于游离脯氨酸，其含量整体呈先上升后趋于稳定趋势，但在室温贮藏条件下贮藏前期增加速度较低温快（表2）。这些结果表明，种子贮藏过程中，MDA和游离脯氨酸相互作用，影响种子活力。

总之，本研究首次针对北方重要阔叶建群树种蒙古栎，探究了其种子不同初始含水量和贮藏温度对种子耐藏性的影响，以及种子贮藏过程中生理生化特性变化。然而，本研究仅探讨了蒙古栎种子贮藏过程中渗透调节物质和抗膜脂过氧化物变化规律，这些物质转化调控以及具体转化时间尚不明确。未来研究，可以从减缓种子呼吸、调控种子可溶性糖和淀粉转化效率，进而提高蒙古栎种子耐藏性。

蒙古栎种子贮藏期间，调整种子含水量和贮藏温度，对其内含物质变化具有显著影响。在蒙古栎种子贮藏过程中，可溶性糖与可溶性蛋白变化呈正相关关系。种子初始含水量越高，可溶性糖早期合成越快。调整蒙古栎种子初始含水量为30%和40%，能有效减缓种子贮藏早期可溶性糖合成，并显著抑制淀粉分解。在贮藏期间，降低种子初始含水量，可以显著抑制MDA 含量的积累、促进脯氨酸含量增加，从而提高蒙古栎种子耐藏性。然而，蒙古栎种子初始含水量降低幅度大小对贮藏过程中MDA 的产生无明显影响，对游离脯氨酸的含量增加有显著影响。总之，蒙古栎种子最适贮藏条件为低温，40%含水量。