海藻糖含量与柞蚕种茧耐贮性关系的研究

陈 欣，刘佩锋，刘书禹，徐 亮，谌苗苗，陈俊山

（辽宁省蚕业科学研究所，辽宁 凤城 118100）

在柞蚕生产上，种茧依靠人工创造的适宜低温环境越冬贮藏以待翌年制种放养，在此期间，虽然柞蚕蛹体表面看不出形态学变化，但实质上其处于滞育后期发育阶段[1]，各项生理代谢活动一直在进行，而所有的生命活动均需要消耗能量，因此其体内能量物质的含量一直呈现动态变化状态[2-3]。由于蛹体完全不进食，低温贮藏期间能量消耗情况对于保障其贮藏期的存活率及贮藏后成虫期的表现尤为重要[4]。前人研究结果表明，糖代谢的变化是昆虫响应温度等逆境的重要过程[5]，糖原是柞蚕蛹滞育期最重要的能量来源之一，也是滞育解除后发育的重要供能物质，其在低温期会转化为具有抗冻保护作用的小分子碳水化合物海藻糖，来提高柞蚕蛹对于低温环境的抵抗能力[6-8]，且海藻糖合成量与抗逆能力呈正比关系[9]，同时这种转化不仅是双向的，在滞育解除后海藻糖又会重新转化为糖原，同时还是一个耗能过程，据此推测，柞蚕蛹脂肪体糖原和血淋巴海藻糖之间的转化能够反映其低温贮藏期的能量消耗情况以及其对低温的耐受能力。

在二化性柞蚕产区，春柞蚕种茧低温贮藏期从11 月下旬至翌年2 月下旬，长达3 个多月，二化一放种茧低温贮藏期更是在此基础上延长3~4 个月，由于低温贮藏期的延长，影响了蛹体正常的生理代谢及发育，因此出现了羽化率低、异常蛾率高以及孵化率低等一系列种蛾质量问题，严重制约了二化一放生产效益[10-12]，前人研究表明，适用于二化性地区的一化性柞蚕品种耐贮性要优于二化性品种[13]，且在家蚕方面有相关研究显示不同的二化性蚕种的耐冷藏性有所差异[14]，因此为根本解决上述问题，本研究试图从糖原和海藻糖之间的转化为切入点，选择在二化一放生产上孵化率高、生命力强、丰产性好的二化性地区一化性品种辽8 为对照[15-16]，对比测定了7 个二化性柞蚕品种种茧在低温贮藏过程中蛹体血淋巴海藻糖和脂肪体糖原含量的变化情况，以期探明糖代谢与种茧耐贮性之间的关系，进一步为选育耐低温贮藏的二化一放柞蚕品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试柞蚕品种为二化性品种大9、凤久、抗大、辽蚕527、辽蚕582、墨玉、青黄1号和一化性品种辽8，均来自辽宁省蚕业科学研究所育种研究室。供试品种2021年秋季统一放养，11月17日统一入库贮藏，库温0~2 ℃。

1.2 主要试剂

海藻糖测定试剂盒（A149-1-1），糖原测定试剂盒（A043-1-1），均由南京建成生物工程研究所生产。

1.3 主要仪器

制冰机（SIM-F140AY65-PC），日本松下公司；高速冷冻离心机（MICRO17R），日本Thermo 公司；医用冰箱（DW-FL270），中科美菱低温科技股份有限公司；恒温水浴锅（HH-2），常州智博瑞仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计（UV2600），日本岛津公司；高精度电子分析天平（ESJ-A），沈阳龙腾电子有限公司。

1.4 取样

每个品种雌雄蛹各5头为一组，在冰浴条件下解剖取血淋巴和脂肪体（加入苯基硫脲），3次重复，取样时间从2021年11月17日入库当天开始至2022年5月17日（二化一放出库期）出库为止，每隔1个月取样1次，样品置于低温冰箱（-80 ℃）备用。

1.4.1 柞蚕蛹血淋巴取样 将8个供试柞蚕品种种茧茧壳割开取出蛹体，雌雄分开，在冰浴条件下取血淋巴（蛹体背部近头位置剪开），每头1 mL，置于2 mL离心管中（离心管提前加入0.1 mg苯基硫脲晶体），冷冻离心机5 000 g·min-1，离心10 min，吸取上清液，将同一品种同一性别每5头蛹血淋巴混匀置于10 mL离心管中为1次重复，取样设3次重复，取完样将样品置于低温冰箱（-80 ℃）备用。

1.4.2 柞蚕蛹脂肪体取样 将取完血淋巴的蛹体在冰浴条件下摘取脂肪体，每头0.2 g，同一品种同一性别每5头蛹脂肪体混匀置于2 mL离心管中（离心管提前加入0.1 mg苯基硫脲晶体）为1次重复，取样设3次重复，取完样将样品置于低温冰箱（-80 ℃）备用。

1.5 测定

为消除因性别造成的糖类物质含量差异，将各品种雌雄蛹分别进行测定，采用蒽酮比色法测定脂肪体糖原和血淋巴海藻糖的含量，具体操作方法均参照对应试剂盒说明书。试剂盒由南京建成生物工程研究所生产，光度值使用岛津UV2600紫外可见分光光度计进行测定，试验设3次重复。

1.6 数据分析

对各品种雌雄蛹测定结果的平均值进行比较，使用SPSS 25 数据处理软件对试验数据进行单因素方差分析和双变量相关性分析。

2 结果与分析

2.1 低温贮藏期柞蚕种茧蛹体血淋巴海藻糖和脂肪体糖原的含量变化

由图1可知，低温贮藏期各品种血淋巴海藻糖和脂肪体糖原含量之间呈现明显的此消彼长的变化趋势，海藻糖峰值出现时间及水平各化性品种间存在差异，二化性品种抗大、辽蚕582、墨玉峰值出现在1月份，大9、凤久、辽蚕527 和青黄1 号以及一化性品种辽8 的峰值则出现在2 月份即春制种出库期，从耐寒物质积累角度分析，此5 个品种在春用种茧保护期具有更好的低温应对能力。3 月份各化性品种海藻糖含量均发生大幅下降，一化性品种降幅显著小于二化性品种，且下降后直至5月份二化一放制种出库期一直显著高于二化性品种，结合一化性品种的耐贮性，推测蛹体血淋巴海藻糖的高水平含量和变化的相对平稳是柞蚕种茧耐长时间低温贮藏的要素。

图1 低温贮藏期各柞蚕品种血淋巴和脂肪体中糖类含量的变化Figure 1 The changes of carbohydrate content in the hemolymph and fat body of every tussah varieties during low-temperature storage time

2.2 不同制种出库期种茧蛹体血淋巴海藻糖含量对比

基于海藻糖的耐寒物质属性，对图1 中不同制种出库期各化性品种蛹体血淋巴海藻糖含量进行进一步的数据对比，对比结果如表1 和图2，各化性品种在二化一放制种出库期相较于春制种出库期血淋巴海藻糖含量均发生显著下降，说明随着低温贮藏期的延长，蛹体耐低温能力发生明显下滑，推测这是引起二化一放种蛾质量下降的原因之一。其中一化性品种下降后含量水平显著高于二化性品种，可见从耐低温能力方面考虑，以海藻糖含量为衡量指标，一化性品种较二化性品种耐长时间低温贮藏，符合一化性品种的耐贮性，二化性品间也存在显著差异，其中下降后仍处于较高水平的是品种大9、凤久、辽蚕527。

表1 不同制种出库期各柞蚕品种血淋巴海藻糖含量的对比Table 1 The hemolymph trehalose content of every tussah varieties at different low temperature storage time

图2 不同低温贮藏时间各柞蚕品种血淋巴海藻糖含量的对比Figure 2 The hemolymph trehalose content of every tussah varieties at different low temperature storage time

2.3 低温贮藏期种茧蛹体血淋巴海藻糖和脂肪体糖原含量的相关性分析

由图1可知，整个低温贮藏期蛹体糖类物质含量呈动态变化，且海藻糖和糖原之间的转化一个是双向耗能的过程。因此，不能单纯的以海藻糖含量为指标衡量品种的耐贮性，对二者含量进行进一步的相关性分析。由表2 可知，皮尔逊相关系数表明一化性品种呈极显著负相关，二化性品种呈显著性负相关，结合一化性品种海藻糖含量在春制种期之后变化趋势相对平稳的情况，可见二者之间相互转化的耗能情况可通过相关性分析来反映，二者相关性越强，说明糖原和海藻糖除彼此转化外很少被蛹体额外消耗和利用。判定系数进一步表明，二化性品种中，大9、凤久、辽蚕52、青黄1 号相关的密切程度（判定系数>0.7）高于其他3 个二化性品种，即此4个二化性品种在低温贮藏期的能源物质利用情况更为合理。

表2 低温贮藏期各柞蚕品种海藻糖和糖原含量相关性分析Table 2 Correlation analysis of trehalose and glycogen content of every tussah varieties in low temperature storage period

3 讨论与结论

海藻糖是一种典型的应激代谢与保护物质，当生物体生长环境良好时，体内不积累海藻糖，而当生物体处于胁迫环境时，体内就会迅速积累海藻糖[17-19]，其存在可以保护生物体在低温、干燥、热激、冷冻、高渗透性、氧化和农药等逆境条件下免受伤害[20-25]，本研究中，各化性柞蚕品种蛹体血淋巴海藻糖含量在入库低温贮藏后总体都呈现积累趋势，与此同时脂肪体糖原呈现相反的下降趋势，统计学分析结果表明二者存在一定程度的相互转化，与前人对昆虫越冬滞育期间关于二者存在转化的研究结果相一致[26-31]。但是海藻糖的积累并不是随着低温环境的持续而一直保持，当海藻糖含量达到一定水平后即发生了下降，与此同时，蛹体脂肪体糖原含量升高，这是因为海藻糖的合成存在负反馈调节机制，即血淋巴中高浓度的海藻糖会抑制6-磷酸海藻糖合成酶，从而转变为糖原合成，测定结果中各化性品种蛹体海藻糖含量峰值出现的时间和含量水平的不同则说明，血淋巴中海藻糖引发负反馈调节机制的浓度存在化性、品种间的差异，结合海藻糖具有的提高虫体抗寒性的作用，说明各化性品种蛹体耐低温能力皆有所不同，到达峰值时间较晚的品种相应的峰值持续时间也较长且峰值水平较高，显然耐贮性更强，暂时的下降之后海藻糖含量再次发生积累，且随着低温贮藏期的延长一化性品种海藻糖含量水平越来越优于二化性品种，体现出一化性品种耐贮性的同时，也与生产上二化一放制种期，二化性地区一化性品种比二化性品种种蛾质量好，蛾卵孵化率高的实际相符，充分证明海藻糖含量与种茧耐贮性直接相关，结合所测试的各二化性品种间存在的显著性差异，说明在二化一放生产上可以以海藻糖的含量为指标衡量二化性种茧的耐长时间低温贮藏能力。但是由于海藻糖与糖原之间的转化是一个双向的耗能过程，由糖原降解每产生1分子海藻糖需要消耗1个ATP，而由海藻糖重新合成糖原，糖原链每增加一个葡萄糖单位就需要耗用2个ATP[32]，可见发生在2至3月间的海藻糖重新转化为糖原的情况，海藻糖下降的越多，显然消耗的能量也越多，因此，从这一角度可见在低温贮藏期一化性品种耗能较少，结合一化性品种的耐贮藏特性，说明较少的耗能是一化性品种比二化性品种耐低温贮藏的原因之一。因此不能简单地以海藻糖含量为种茧耐低温贮藏的衡量指标，贮藏期其与糖原转化间能量的消耗也是需要考虑的因素，本研究中这种能量的消耗可以通过相关性分析得到直观的体现，二者转化的相关系数越高，说明转化效率越高，能量被额外消耗的越少，越有利于长时间低温贮藏。

此外，由于本研究试验过程中将各品种雌雄蛹体进行分开测定，数据分析过程中还发现各品种雌性蛹体比雄性蛹体血淋巴海藻糖含量更高，且其与脂肪体糖原之间转化系数也更高，说明雌蛹比雄蛹更耐低温贮藏，这也从能源物质利用和耐寒物质积累角度证明了前人在实际生产中曾采用“二交一”的办法解决“二化一放”生产难题的合理性。综上，通过与一化性品种的对比，以及二化性品种间具有的显著差异，明确了海藻糖含量及其在低温贮藏期与糖原含量的相关程度可作为衡量柞蚕种茧耐贮性的指标，并以之为参考初步筛选出了3 个较耐长时间低温贮藏的二化性品种，该研究结果可为柞蚕耐贮性研究以及二化一放柞蚕品种选育提供参考。