基因重组鲎试剂检测促肝细胞生长素注射液中细菌内毒素含量适用性研究

刘书显，陈 彤，阮 健

（山东省烟台市食品药品检验检测中心，山东 烟台 264570）

鲎试剂（LAL）是鲎血细胞提取物制备的裂解试剂，广泛用于非肠道用药和医疗器械的内毒素检测。天然鲎试剂使用存在以下3个问题：1）持续使用会导致鲎减少降［1-2］；2）地域和季节不同会导致批间差异，影响检测结果［3-4］；3）通过旁路途径G因子通路与1，3-β-D-葡聚糖反应，可能导致假阳性结果［5-6］。基因重组鲎试剂作为一种新的重组显色试剂逐渐用于国外制药领域细菌内毒素的定量检测［7］。其由C 因子、B 因子和凝固酶原这3 种重组蛋白酶酶原组成，可用于复制级联反应，提供一种动力学显色法。有研究显示，基因重组鲎试剂能满足相关规定中细菌内毒素的检测标准［8］。鉴于此，本研究中使用基因重组鲎试剂和天然美洲鲎试剂定量检测促肝细胞生长素注射液中细菌内毒素含量，并比较检测结果，为基因重组鲎试剂的使用提供实验依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

PKF96 - OE - 2774 型细菌内毒素定量检测系统（美国Cape Cod公司，配套专用软件）。

1.2 试药

促肝细胞生长素注射液（威海赛洛金药业有限公司，批号分别为2101005，2007013，2006005，2107032，2106027，2106026，2106025，2106024，2106023，2106022，2106021，2106020，2106019，1912049，2101006，2101001，2104011，2104013，2104016，2101004，2104014，2104010，2104018，2012025，2104015，2104017；规格均为每支2 mL∶30 µg）；基因重组鲎试剂（批号为2630001，可检测内毒素浓度范围50～0.005 EU/ mL，规格为每支2.8 mL），配套复溶缓冲液（批号为2631001），天然美洲鲎试剂（批号为2042102，可检测内毒素浓度范围0.001～10 EU/ mL，规格为每支3.2 mL），配套葡聚糖抑制缓冲液（批号为1207078），细菌内毒素工作标准品（批号为249034），细菌内毒素检查用水（BET 水，批号为AF29482230），均购自美国Cape Cod公司。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值及最大有效稀释倍数的确定

按2020 年版《中国药典（四部）》通则1143 细菌内毒素检查法规定［9］，细菌内毒素限值公式为L=K/M，其中，L为供试品细菌内毒素限值，注射剂K值为5 EU/（kg·h），M为人用每千克体质量每小时的最大供试品剂量［mL/（kg·h）］。按供试品说明书规定，促肝细胞生长素注射液M=8÷（60×1）mL/（kg·h），得L为37.5 EU/mL。最大有效稀释倍数公式为MVD=cL/λ，其中c（供试品溶液浓度）为1.0 mL/ mL，L为37.5 EU/ mL，λ 为标准曲线上最低的内毒素浓度（0.008 EU/mL），得MVD 为4 687.5。

2.2 标准曲线可靠性试验

取细菌内毒素工作标准品适量，用BET 水配制成浓度分别为5，1，0.2，0.04，0.008 EU / mL 的系列标准溶液，每一浓度平行3管；以BET水为阴性对照，平行2管，每管200 µL，分别加入装有50 µL 复溶缓冲液鲎试剂的反应管中，混匀，置仪器中，设置反应温度为（37 ± 0.2）℃，检测波长为405 nm，检测。反应结束后将获得的反应时间与标准品溶液浓度进行线性回归，得回归方程，以|r|≥0.980为试验有效［10-11］。

以细菌内毒素浓度的对数（lgC）为横坐标、反应时间的对数（lgT）为纵坐标进行线性回归（见表1），结果表明，细菌内毒素浓度与反应时间线性关系良好，且阴性对照管反应时间均大于标准曲线最低浓度的反应时间，标准曲线成立。

表1 线性回归结果Tab.1 Results of the linear regression analysis

2.3 供试品干扰试验

取2 批内毒素含量偏高的供试品适量，分别用2 种鲎试剂稀释20 倍，其他批次样品稀释2 倍，作为供试品溶液；同时配制相同倍数含内毒素标准品浓度为0.2 EU/mL的溶液，作为阳性对照，每一浓度重复2管，按2.2项下方法测定。

按回归方程得出供试品溶液和含标准细菌内毒素供试品溶液的内毒素含量分别为ct和cs，按公式R=（cs-ct）/λm×100%。计算回收比，其中λm为0.2 EU/mL，回收比应在50%～200%之间。

结果见表2和表3。不同稀释倍数下，细菌内毒素的回收比均符合规定（50%～200%），则在此条件下供试品溶液未产生干扰作用。

表2 基因重组鲎试剂定量检测样品中细菌内毒素含量（n=2）Tab.2 Results of content determination of bacterial endotoxins in samples by recombinant LAL（n=2）

表3 天然美洲鲎试剂定量检测样品中细菌内毒素含量（n=2）Tab.3 Results of content determination of bacterial endotoxins in samples by LAL（n=2）

2.4 细菌内毒素含量测定

使用基因重组鲎试剂，按2.2 项下方法测定。结果26批样品均检测出内毒素，含量在0.018 1～3.72 EU/mL之间；使用天然美洲鲎试剂，其中1 批样品未检测出内毒素（含量＜0.016 EU/ mL），另25 批内毒素，含量在0.0352～5.24 EU/mL之间，但均小于限值（37.5 EU/mL）。两种鲎试剂测定的细菌内毒素含量无显著差异（P＞0.05），表明两者细菌内毒素检测结果一致性较好。

3 讨论

相较于家兔热原检查法，光度法具有检测速度快、结果可定量等优点［10-12］。本研究结果显示，26 批样品中内毒素含量均小于限值（37.5 EU/mL），但批间内毒素含量差异较大，其中2 批样品（批号分别为2007013，1912049）内毒素含量偏高，且后者以基因重组鲎试剂检出值达5.24 EU/ mL。细菌内毒素含量偏高，可能与原料来源和生产工艺有关。生产厂家应加强对原料中细菌内毒素的控制，改进生产工艺，进而控制药品的细菌内毒素含量至更低水平，以提高其安全性。

本研究中的2 种鲎试剂对26 批样品内毒素含量检测结果无显著差异，表明2种鲎试剂的动态显色法试验结果一致性较好，且均满足2020年版《中国药典（四部）》通则1143细菌内毒素检查法中光度测定法的要求，可考虑用基因重组鲎试剂代替天然鲎试剂进行药品内毒素含量检测。

有研究显示，与天然鲎试剂比较，基因重组鲎试剂产品批间差异较小［13］，可有效避免天然鲎试剂导致测试结果差异大的问题，且避免了与1，3-β-D-葡聚糖交叉反应造成假阳性结果的干扰［8］，是一种有效可行的细菌内毒素定量检测鲎试剂。试剂成分采用基因工程技术获得，不必由鲎活体来提供，从保护鲎资源的角度出发［14］，重组鲎试剂技术可能比依赖自然资源的天然鲎试剂技术优势更大。

综上所述，使用基因重组鲎试剂、天然美洲鲎试剂采用动态显色法测定的促肝细胞生长素注射液内毒素含量结果相当。本研究中建立了该制剂内毒素的定量检测方法，准确性和灵敏度好，能快速定量检测促肝细胞生长素注射液中的细菌内毒素含量，可用于该产品生产、流通环节细菌内毒素的质量控制。