降脂通络软胶囊治疗高脂血症作用机制的网络药理学分析

陶晓宇，高艺菲，金政森，陈美琳，陆珊，郭思宇，张景媛，张繁芹，赵若琪，吴嘉瑞（北京中医药大学中药学院，北京 100029）

高脂血症（Hyperlipidemia，HLP）多见于中老年人，是心脑血管疾病发生的主要危险因素之一，具有症状多样、证候复杂、涉及脏器多等特点[1]，其发病率有逐年上升的趋势[2]。西医多使用以降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）为主的他汀类、树脂类药物和以降低血清三酰甘油为主的贝特类及烟酸类药物[3]，虽然疗效显著，但存在不同程度的副作用[1]。中医认为高脂血症是由于肝失疏泄、心气虚衰等原因造成血行不畅、脉道阻塞，日久则导致气滞血瘀，故中医主张活血化瘀是治疗气滞血瘀型高脂血症的基本治则[4]。

降脂通络软胶囊是神威药业集团有限公司研制的治疗高脂血症（气滞血瘀证）的二类中药新药[5]，原名脂可平软胶囊。采用超临界CO2萃取技术从姜黄中提取得到其有效成分总姜黄素，以总姜黄素为主要原料制成降脂通络软胶囊[5]，具有活血行气、降脂祛浊的功效，适用于高脂血症属血瘀气滞证，症见胸胁胀痛、心前区刺痛、胸闷、舌边尖有瘀点或瘀斑、脉弦或涩者[6]。临床观察[4]显示，降脂通络软胶囊对气滞血瘀型高脂血症疗效确切，有明显的降脂作用。动物实验[7-8]也显示，降脂通络软胶囊中的姜黄素能够通过上调LDL-C 受体表达，促进脂肪转化成糖，从而抑制胆固醇合成，加速胆固醇清除。研究[9]表明，姜黄素类成分对高脂血症小鼠血清多不饱和鞘磷脂具有调节改善作用，可能与调节脂质代谢紊乱相关。然而其治疗高脂血症的分子作用机制尚不明确，故本研究拟采用网络药理学分析和分子对接验证相结合的方法[10]，分析降脂通络软胶囊中的有效成分总姜黄素类成分治疗高脂血症的分子作用机制，以期为降脂通络软胶囊治疗高脂血症的临床及实验研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 降脂通络软胶囊活性成分筛选及其靶点预测通过系统检索中国知网（https://www.cnki.net）、万方数据库（https://www.wanfangdata.com.cn）、Pubmed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）等中外文献数据库和中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），获取降脂通络软胶囊中的姜黄素类成分。利用TCMSP 数据库，并以口服生物利用度（Bioavail ability，OB）≥30%、类药性（Drug likeness，DL）≥0.18 为筛选条件；以及利用SwissADME 数据库（http://www.swissadme.ch/index.php），以胃肠吸收（Gatrointestinal absortion，GI absortion）为“High”，且类药性（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Mue-gge）预测结果中有2 个或2 个以上使用“Yes”为药动学准则，筛选出降脂通络软胶囊中的姜黄素类活性成分。

在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中查找姜黄素类活性成分的标准Smiles号[11]，通过SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch）数据库预测不同成分的靶点基因[12]，并筛选出Probability＞0 的靶点，作为每个活性成分的预测靶点。然后，利用Cytoscape 3.7.2软件构建降脂通络软胶囊的“药物-活性成分-预测靶点”网络。

1.2 “活性成分-潜在作用靶点-疾病”网络的构建以“Hyperlipidemia”为关键词，分别通过GeneCards（https://www.genecards.org/Guide/GeneCardsTeam/）、DisgeNet（https://www.disgenet.org/downloads/）、OMIM（https://www.omim.org）数据库进行疾病相关靶点检索，筛选出“Score”大于中位数的靶点，即高脂血症的疾病相关靶点。将高脂血症的疾病相关靶点和降脂通络软胶囊活性成分预测靶点进行对比，取二者的交集，作为降脂通络软胶囊治疗高脂血症的潜在作用靶点。利用Cytoscape 3.7.2软件构建降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“活性成分-潜在作用靶点-疾病”网络。

1.3 潜在作用靶点的蛋白相互作用（PPI）网络构建将降脂通络软胶囊治疗高脂血症的潜在作用靶点输入STRING（https://cn.string-db.org）数据库中，进行PPI运算。将PPI结果导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建降脂通络软胶囊治疗高脂血症潜在作用靶点的PPI关系网络，并对该网络进行拓扑学性质分析，筛选出降脂通络软胶囊治疗高脂血症的关键靶点。

1.4 关键靶点的GO 功能及KEGG 通路富集分析为了进一步探讨降脂通络软胶囊治疗高脂血症关键靶点的作用机制，基于Bioconductor（https://www.bioconductor.org）信息网站的R 语言程序，通过“clus-terProfile”“DOSE”“org.Hs.eg”等语言包对“1.3”项下筛选出的降脂通络软胶囊治疗高脂血症的关键靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）3 个方面，并可视化展示富集结果每项排前15 位的条目数据；分析注释关键靶点基因主要参与的代谢途径，并可视化展示富集结果排前20 位的通路数据[13]。富集结果利用R 软件中的GO plot 包可视化，并以气泡图的形式展示。

1.5 “核心活性成分-核心靶点-核心通路”网络的构建利用Cytoscape 3.7.2软件对KEGG 富集分析结果中富集程度排前10 位的核心通路、51 个关键靶点和20 个活性成分，构建降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“活性成分-关键靶点-核心通路-疾病”网络。并对该交互网络的拓扑学特征进行分析，选取紧密度（Degree）、介度中心性（Betweenness centrality，BC）及紧密度中心性（Closenesss centrality，CC）值皆大于中位数且Degree 值均大于10 的活性成分，再分析各个成分与靶点的结合情况，筛选得到核心活性成分；筛选出Degree、BC及CC皆大于中位数且Degree值大于15 的关键靶点作为核心靶点。再通过Cytoscape 3.7.2 软件构建降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“核心活性成分-核心靶点-核心通路”网络。

1.6 分子对接验证基于“1.5”项下“核心活性成分-核心靶点-核心通路”网络中的核心靶点及核心活性成分进行分子对接验证，评估靶点和成分的对接情况，以初步验证网络药理学分析结果。在Pubchem 数据库中获取核心成分3D 结构的sdf 文件，通过ChemOffice 软件将成分结构的sdf 格式改为pdb格式[14]；采用Autodock Tools 1.5.7软件设置其旋转键及活性键移动时所需要的最少原子数目，然后输出pdbqt 格式文件。通过PDB 数据库（https://www.rcsb.org）检索核心靶点的蛋白结构并下载；利用Notepad软件去除杂原子后导入Autodock Tools 1.5.7软件，依次进行计算电荷、添加氢原子、融合非极性离子等操作，输出为pdbqt格式文件。将核心成分和核心靶点的pdbqt 格式文件均导入Autodock Tools 1.5.7 软件中，获取相应活性口袋，设置Gridbox 坐标及大小，运行Autodock Vina 脚本进行分子对接，并利用Pymol软件进行对接结果可视化。

2 结果

2.1 降脂通络软胶囊的活性成分结果见表1。降脂通络软胶囊中的有效成分是姜黄素类活性成分，故结合文献结果[15]及TCMSP 数据库筛选，共得到20 个降脂通络软胶囊的活性成分。

2.2 降脂通络软胶囊的“药物-活性成分-预测靶点”网络降脂通络软胶囊中的20 个姜黄素类活性化合物可在SwissTargetPrediction 数据库中预测得到412个靶点基因。将所得到的相关活性成分及其预测靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建“药物-活性成分-预测靶点”网络，见图1。该网络由433 个结点和1 538 条边组成，图中六边形节点代表药物（姜黄），菱形节点代表预测靶点，箭头形节点代表活性成分。Degree值表示与节点相连接的边数[16]，某预测靶点节点的Degree 值越大，则说明其与降脂通络软胶囊中活性成分的关联度越大。其中，表皮生长因子受体（EGFR）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基（PIK3CA）、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAF1）、11-B-羟基类固醇脱氢酶1（HSD11B1）4 个节点的Degree 值≥20，可能是降脂通络软胶囊活性成分在机体中发挥治疗作用的重要靶点。

2.3 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“活性成分-潜在作用靶点-疾病”网络通过DisgeNet、GeneCards、OMIM 3 个疾病数据库共筛选出1 734 个高脂血症疾病相关靶点。对降脂通络软胶囊活性成分的预测靶点与高脂血症疾病相关靶点取交集，得到139个共有靶点，即为降脂通络软胶囊治疗高脂血症的潜在作用靶点，见图2。

图2 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的潜在作用靶点Figure 2 Potential targets of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

将降脂通络软胶囊活性成分、潜在作用靶点导入Cytoscape 3.7.2软件中，利用“Merge”工具构建降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“活性成分-潜在作用靶点-疾病”网络，见图3。该网络图中共包括160个节点和1 561 条边。其中，中心的六边形节点代表疾病，菱形代表潜在作用靶点，外周的箭头形节点代表活性成分，边代表活性成分-潜在作用靶点及疾病-靶点之间的关系，节点的大小与Degree 值呈正比。环绕在中心疾病节点周围的6 个较大的节点为HSD11B1、RAF1、APP、BRAF、ALOX5、PIK3CA，其Degree 值均≥14，其中HSD11B1、RAF1、PIK3CA的Degree 值同时在“2.2”项的“中药-活性成分-预测靶点”网络中排前5位。

图3 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“活性成分-潜在作用靶点-疾病”网络Figure 3 “Active components-potential targets-diseases” network of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

2.4 降脂通络软胶囊治疗高脂血症潜在作用靶点的PPI 网络将139个降脂通络软胶囊治疗高脂血症的潜在作用靶点（交集靶点）导入STRING数据库，限定物种为“智人（Homo sapiens）”，选取置信度＞0.4 的PPI关系数据，导入Cytoscape 3.7.2构建PPI网络，共有136 个节点，1 397 条边，见图4-A。根据网络拓扑学性质，分析该PPI 网络节点中的Degree、BC、CC值来评估其拓扑特征，以中位数为标准即Degree≥14、BC≥0.001 725、CC≥0.498 155[17]，筛选得51 个关键靶点，见图4-B。

图4 降脂通络软胶囊治疗高脂血症潜在作用靶点的PPI 网络Figure 4 PPI network of potential targets of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

2.5 关键靶点的GO 功能及KEGG 通路富集分析降脂通络软胶囊治疗高脂血症的51个关键靶点的GO功能及KEGG 通路富集分析结果见图5。图中纵坐标为GO 条目或通路名称，横坐标为富集基因比率，颜色深浅程度代表GO 条目或通路的显著性。GO 功能富集到2 232 个条目，其中共涉及2 013 个生物过程相关条目，前15 个条目涉及化学反应、细胞生物调节、细胞增殖等；共涉及76 个细胞组成相关条目，前15 个条目涉及囊泡、膜筏、内膜系统等；共涉及143个分子功能相关条目，前15个条目主要包括分子结合、信号受体结合、激酶反应等。KEGG通路富集分析共得到155 条通路，其中前10 条显著通路包括癌症通路、PI3K-Akt 信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、脂质和动脉粥样硬化、HIF-1 信号通路、癌症中的蛋白多糖、前列腺癌、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、人类免疫缺陷病毒1感染。

图5 降脂通络软胶囊治疗高脂血症关键靶点的GO 功能及KEGG 通路富集分析Figure 5 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

2.6 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“核心活性成分-核心靶点-核心通路”构建降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“活性成分-关键靶点-核心通路-疾病”网络，见图6。该网络中包括82个节点、471条边，对该交互网络的拓扑学特征进行分析，筛选得到8 个核心成分即JH1、JH2、JH3、JH4、JH11、JH13、JH16、JH17（见表2），得到3个核心靶点包括PIK3CA（磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α 亚型）、EGFR（表皮生长因子受体）、RAF1（RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶），进一步构建得到降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“核心活性成分-核心靶点-核心通路”网络，见图7。

图6 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“活性成分-关键靶点-核心通路-疾病”网络Figure 6 “Active components-key targets-core pathways-diseases” network of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

图7 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的“核心活性成分-核心靶点-核心通路”网络Figure 7 “ Core components-core targets-core pathways” network of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

表2 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的核心成分Table 2 Core components of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

2.7 分子对接验证选取“2.6”项下“核心活性成分-核心靶点-核心通路”网络中的3 个核心靶点分别与8 个核心成分进行分子对接，结果见表3。vina 值越小，表示分子对接的效果越好，vina 值＜-5.0 kcal·mol-1表示二者具有良好的结合活性。对亲和力预测值较高的结果通过开源软件Pymol[18]作可视化处理，结果见图8。图中突出显示部分为小分子配体和与其相结合的受体结合位点氨基酸，均以棒状结构显示，黄色虚线代表小分子配体与受体相结合的氢键，标注文字为氨基酸残基的名称。

图8 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的核心活性成分与核心靶点的分子对接3D 图Figure 8 3D Diagram of molecule docking results of core components and core targets of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

表3 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的核心活性成分与核心靶点分子对接结果Table 3 Molecule docking results of core components and core targets of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

3 讨论

本研究结果显示，姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、二氢姜黄素、四氢姜黄素、六氢姜黄素等是降脂通络软胶囊治疗高脂血症的核心活性成分。有研究[19]发现，姜黄素类成分可以激活PPAR-α/CPT-1A 表达，促进脂肪酸β 氧化，改善急性高脂血症大鼠的血脂异常，并降低血清FFA 及肝脏FFA、TG 水平，改善肝细胞损伤及脂肪沉积。姜黄素还能通过降低血脂及诱导Nrf2 表达，增强SOD活力，提高主动脉的抗氧化能力，调节内皮依赖的舒血管作用，改善动脉病理损伤，发挥预防动脉硬化性心血管疾病的作用[20]。

EGFR、RAF1 和PIK3CA 是降脂通络软胶囊治疗高脂血症的核心靶点，通过分子对接显示其与核心活性成分具有良好的结合活性。EGFR与代谢紊乱相关，能够通过减少胆固醇的合成以及增强脂肪酸氧化来减少脂肪积累和肝细胞损伤，EGFR可能是治疗血脂异常的潜在靶点[21]。小檗碱能够通过AMPK依赖性RAF1激活并上调肝细胞中LDL受体的表达，减少脂肪细胞中的脂肪堆积[22]。PIK3CA编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylino-sitol 3-kinases，PI3Ks）的p110α催化亚单位即PI3Kp110α。PI3K-Akt 信号通路通过磷酸化叉头转录因子（FOXO）调控糖代谢，而葡萄糖氧化分解生成的乙酰辅酶A（CoA）是脂肪酸合成的原料，因此PI3K-Akt信号通路可间接调节脂代谢[23]。

KEGG通路富集分析结果显示，降脂通络软胶囊可通过调节脂质和动脉粥样硬化、PI3K-Akt 信号通路等方面影响高脂血症的发展过程。51 个关键靶点中有20 个靶点富集在脂质和动脉粥样硬化信号通路上，有22个靶点富集在PI3K-Akt信号通路。通过查询KEGG 信号通路网站（https://www.genome.jp/kegg/）和检索相关文献，对脂质和动脉粥样硬化信号通路及PI3K-Akt 信号通路进行分析。脂质和动脉粥样硬化通路主要涉及PI3K、Akt，通过上调PI3K-Akt 信号通路降低Toll 样受体4（TLR 4）的表达，可以减少泡沫细胞的形成，防止动脉粥样硬化斑块的形成和不稳定[24]。另外，PI3K 能与多种细胞表面受体结合，激活以AKT 信号通路为主的下游信号通路，通过参与细胞凋亡、巨噬细胞表型转化，以及参与抗血小板聚集、抗炎、调控氧化应激、自噬等方面调节动脉粥样硬化[25]。因此，降脂通络软胶囊可能通过调控脂质和动脉粥样硬化通路及PI3K-Akt 信号通路来改善高脂血症，见图9。

图9 降脂通络软胶囊治疗高脂血症的相关信号通路示意图Figure 9 Schematic diagram of signal pathway of Jiangzhi Tongluo Soft Capsules in the treatment of hyperlipidemia

综上所述，本研究采用网络药理学方法及分子对接初步分析了降脂通络软胶囊治疗高脂血症的核心活性成分、靶点及通路。降脂通络软胶囊治疗高脂血症的作用可能是通过姜黄素、去甲氧基姜黄素等核心活性成分，作用于EGFR、RAF1和PIK3CA等核心靶点，通过PI3K-Akt 通路、脂质和动脉粥样硬化通路等多条信号通路来实现的。本研究可为降脂通络软胶囊治疗高脂血症的进一步实验及临床研究提供参考，但相关研究结果仍有待进一步的生物学验证。