载药MOF涂层抗菌真丝缝合线的制备及性能

邹雨航，张 倩，魏乐倩，毛吉富，c，d，王 璐，c，d

(东华大学 a.纺织学院,b.纤维材料改性国家重点实验室,c.纺织面料技术教育部重点实验室,d.纺织行业生物医用纺织材料与技术重点试验室, 上海 201620)

真丝是一种天然的蛋白质纤维,真丝编织缝合线具有优异的拉伸强度、良好的操作手感和打结性能,且价格低廉,在各类外科手术中应用广泛。但是,真丝缝合线的编织结构为细菌黏附提供了良好的场所,容易引起手术部位感染(surgical site infections, SSIs),极大地增加了患者的手术风险[1-3]。因此,开发抗菌真丝缝合线具有重要的临床意义和迫切性。

姜黄素(curcumin, Cur)是一种具有良好生物相容性和生物可降解性的天然化合物,具有抗炎[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]、抗癌[7]等多种作用,在预防和治疗多种疾病方面具有较大的潜力。此外,Cur在伤口愈合的各个阶段均起作用,可增强肉芽组织形成、胶原沉积、组织重塑和创面收缩,加速伤口愈合[8-9]。基于此,利用Cur对真丝缝合线进行表面改性将可能赋予其抗菌性并促进伤口愈合。然而,Cur溶解度和稳定性较差,因此难以被直接使用,需要寻求合适的药物载体。

金属有机框架(metal organic framework, MOF)是一种金属离子和有机配体通过配位共价键组装而成的纳米多孔材料。沸石咪唑酯骨架材料(zeolitic imidazolate framework-8, ZIF-8)是由锌离子和2-甲基咪唑构筑的具有良好生物相容性的MOF,其不仅具有较高的热稳定性和水热稳定性,而且可作为药物运输的载体[10]。现有研究[11-13]表明,ZIF-8具有促进细胞增殖、血管重建、抗菌的作用,还可作为Cur载体增强Cur的溶解度和稳定性。本文以ZIF-8为Cur的功能载体合成纳米抗菌材料,并将其修饰到真丝缝合线上构建抗菌缝合线。通过一系列体外试验探究了缝合线的理化性能、抗菌性能和生物相容性,以期为新型抗菌真丝缝合线的开发提供新思路。

1 试验部分

1.1 试验原料

六水合硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O)、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、无水乙醇均购自国药集团化学试剂有限公司;甲醇购自上海麦克林生化科技有限公司;Cur购自上海易恩化学技术有限公司;2-甲基咪唑(2-methylimidazole, 2-MIM)、盐酸多巴胺均购自美国Sigma-Aldrich公司;真丝(线密度为6.67 tex,2根真丝合股)购自浙江嵊州协和丝绸有限公司。

1.2 ZIF-8@Cur的制备

称取2.10 g的 Zn(NO3)2·6H2O溶解在70 mL的超纯水中;再将4.62 g的2-MIM、70 mg的Cur溶解在140 mL甲醇中;在转速为700 r/min磁力搅拌下将Zn(NO3)2·6H2O溶液快速倒入2-MIM/Cur溶液中,搅拌1 min后溶液呈橘红色即生成负载Cur的ZIF-8;在离心率为8 000 r/min的转速下离心20 min(离心半径为4 cm),收集产物;最后利用甲醇洗涤3次,得到的负载Cur的ZIF-8命名为ZIF-8@Cur。将产物ZIF-8@Cur用甲醇稀释至1,5,10,15,20 mg/mL,备用。在不添加Cur的前提下,利用相同的方法制备纯ZIF-8。

1.3 真丝编织缝合线的制备

试验采用8根真丝作为壳纱、再将2根相同的真丝作为芯纱,使用国产8锭立式医用编织机,制备2-0型真丝编织缝合线,齿轮比选用82/22,命名为S。

1.4 MOF载药抗菌缝合线的制备

为了增强载药MOF在缝合线表面的负载效果,利用多巴胺对缝合线进行表面改性。具体方法:先配置2 mg/mL的多巴胺溶液,将缝合线S浸渍于其中24 h;然后将清洗干燥所得到的缝合线命名为S/PDA;最后将S/PDA浸泡在1,5,10,15,20 mg/mL的ZIF-8@Cur溶液中12 h,取出后清洗干燥,制备出的载药MOF涂层真丝缝合线分别命名为S/ZC1,S/ZC5,S/ZC10,S/ZC15,S/ZC20。

1.5 测试与表征

1.5.1 表面形貌

使用SU8010型场发射扫描电镜(SEM)观察ZIF-8@Cur和涂层前后真丝缝合线的表面形貌。使用JEM-2100透射电子显微镜(TEM)观察ZIF-8@Cur的表面形貌。

1.5.2 化学结构

使用Spectrum Two型红外光谱仪测定ZIF-8@Cur和缝合线的红外光谱,扫描的波长为400～4 000 cm-1。使用Bruker D8型X射线衍射仪(XRD)对ZIF-8@Cur进行X射线衍射,分析材料的成分。使用X射线光电子能谱仪(XPS)分析缝合线表面元素。使用全自动比表面积分析仪(BET)测定ZIF-8和ZIF-8@Cur的比表面积、孔体积与孔隙度。

1.5.3 热稳定性

使用TG209F1型热重分析仪测试ZIF-8@Cur的热稳定性,测试条件为氮气氛围,温度为50～800 ℃,升温速度为10 ℃/min。

1.5.4 ZIF-8@Cur载药量与包封率的测定

使用紫外分光光度计(UV-vis),将Cur、ZIF-8和ZIF-8@Cur分别分散在甲醇溶液中,测量三者在190～900 nm波长的吸收曲线。将Cur分散在盐酸和乙醇体积比为1∶9的溶液中,测量其在433 nm处,质量浓度为0,1,2,4,8,16 μg/mL的吸光度值,并绘制标准曲线。取10 mg ZIF-8@Cur,用上述盐酸/乙醇溶液稀释,计算其载药量、包封率,分别如式(1)和(2)所示。

(1)

式中:mZ为ZIF-8@Cur中Cur的质量,mg;mZC为ZIF-8@Cur的质量,mg。

(2)

式中:mc为 Cur的总投入质量,mg。

1.5.5 缝合线药物上载量的测定

取15 cm涂层后的真丝缝合线,浸泡在盐酸(质量分数为10%)和乙醇溶液中24 h,测定433 nm处的吸光度,并代入标准曲线计算。

1.5.6 缝合线线径的测定

使用CH-12.7-BTSX型测厚仪测量真丝缝合线直径,每个样品测试10次,结果取平均值。

1.5.7 拉伸性能

使用HY-940FS型电脑式拉压力试验机测试缝合线的断裂强力和伸长率。参考YY 0167—2020《非吸收性外科缝线》标准,测试参数中隔距为100 mm,拉伸速率为200 mm/min,每个样品测试5次,结果取平均值。

1.5.8 抗菌性能

通过琼脂平皿扩散法来表征缝合线的抗菌性。将大肠埃希菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)分别放入含有肉汤的试管中培养18 h,取出后用棉签蘸取浓度为108CFU/mL的菌液,均匀涂抹在配制好的牛肉膏蛋白胨固体培养基上,用镊子夹取5 cm的待测缝合线,贴放在平板表面,盖好平板并倒置于 37 ℃恒温培养箱培养24 h,取出后读取抑菌带外径宽度。

抑菌带宽度的计算如式(3)所示。

(3)

式中:H为抑菌带宽度,mm;D为抑菌带外径的平均宽度,mm;d为试样平均直径,mm。

1.5.9 细胞相容性

样品准备:将样品用去离子水浸泡48 h,干燥后裁剪成长度为1.5 cm并放置于24孔细胞培养板内。样品使用前放置于含75%乙醇的酒精蒸缸中24 h,取出后用无菌PBS浸泡12 h后,最后细胞接种前用无菌PBS清洗两次,以去除样品中残留的乙醇。

细胞接种与培养:复苏人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast, HFF-1)第25代,于细胞培养箱中(温度为37 ℃,CO2质量分数为5%)培养至细胞汇合度达90%。使用EDTA-胰酶将细胞从培养瓶中脱落下来并转移至离心管中。经离心后得到细胞沉淀物,加入1 mL完全培养基制得细胞悬浮液;取10 μL上述悬浮液,用无菌PBS稀释至100 μL,统计稀释细胞悬液中的细胞数量以确定细胞密度,计数后配制细胞密度为4×104个/mL的细胞悬浮液。将上述细胞悬浮液加入24孔培养板中,500 μL/孔。每两天更换一次细胞培养液。

细胞增殖率:细胞培养至第1,3,7 d时,取出24孔培养板,移除培养孔内样品,并吸去细胞培养孔内培养基,使用无菌PBS洗去孔内残余液体;配制由质量分数为90%高糖DMEM和质量分数为10%CCK-8试剂混合的CCK-8工作液,然后将上述溶液加入培养板(500 μL/孔),于培养箱中孵育3 h。孵育结束后将溶液转移至96孔板,在酶标仪中测量其在波长450 nm处的吸光度。

细胞增殖率计算公式如式(4)所示。

(4)

式中:Dt为所测样品的吸光度值;D0为空板吸光度值;Dc为空白对照组的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 载药MOF的表面形貌与结构

2.1.1 ZIF-8和ZIF-8@Cur的表面形貌

通过SEM观察ZIF-8和ZIF-8@Cur的表面形貌,结果如图1(a)(b)所示。由图1(a)和(b)可知,ZIF-8和ZIF-8@Cur呈规则的晶体结构,粒径大小均匀,其中ZIF-8颗粒直径为120 nm左右,ZIF-8@Cur粒径直径为160 nm左右,与文献[14]所报导的结果相吻合。透射电镜观察ZIF-8和ZIF-8@Cur的表面形貌,如图1(c)和(d)所示,与扫面电镜观察的结果相近。

图1 不同试样的SEM和TEM图Fig.1 SEM and TEM images of different samples

2.1.2 ZIF-8和ZIF-8@Cur的化学结构

图2 不同试样的FTIR,XRD和TGA图Fig.2 FTIR,XRD and TGA images of different samples

2.1.3 不同试样的热稳定性

通过TGA测试表征ZIF-8@Cur、ZIF-8、Cur等3种试样的热稳定性,结果如图2(c) 所示。由图2(c)可知,随着温度的升高,Cur在200 ℃时开始失重下降,ZIF-8和ZIF-8@Cur在600 ℃左右结构开始崩塌,ZIF-8@Cur在300 ℃开始出现第一次快速失重,在600 ℃处ZIF@Cur 比ZIF-8多损失8.66%,这是由负载的Cur开始降解导致的。

2.1.4 不同试样的紫外光谱图与ZIF-8@Cur载药量

图3 为Cur、ZIF-8、ZIF-8@Cur在甲醇中的紫外光谱图。由图3可知,Cur在421 nm处出现特征峰,ZIF-8@Cur在418 nm处出现特征峰,说明Cur成功负载到ZIF-8上。图4为Cur在盐酸/乙醇溶液体系中测试绘制的标准曲线为(y=0.164 6x+0.006 7;R2=0.998 9)。利用ZIF-8在酸性条件下崩解的特点[15],并借助该标准曲线计算得到ZIF-8@Cur的载药量为8.52%,包封率为70.29%。

图3 不同试样在甲醇溶液中的紫外-可见吸收光谱图Fig.3 UV-vis absorption of different samples in methanol solution

图4 Cur在盐酸和乙醇溶液中的标准曲线Fig.4 The standard curve of Cur in hydrochloric acid and ethanol solution

2.1.5 ZIF-8和ZIF-8@Cur的比表面积分析

通过BET分析,ZIF-8和ZIF-8@Cur的比表面积、微孔体积和孔径结果如表1所示。由表1可知,ZIF-8@Cur的比表面积为1 538.48 m2/g,微孔体积为0.50 cm3/g,孔径为1.18 nm,相比ZIF-8均有所下降,更加证实Cur成功负载到ZIF-8纳米孔中。

表1 ZIF-8和ZIF-8@Cur的比表面积、微孔体积和孔径

2.2 载药MOF涂层抗菌真丝缝合线的表征

2.2.1 涂层前后真丝缝合线的表面形貌

通过SEM观察分析涂层前后缝合线表面形态变化,结果如图5所示。由图5可知,未经涂层处理的缝合线表面光滑平整,涂层后缝合线表面都存在ZIF-8@Cur纳米颗粒,随着ZIF-8@Cur质量浓度的增大,缝合线表面的纳米颗粒的数量增加,其中S/ZC15组缝合线表面纳米颗粒涂层较为均匀平整,S/ZC20组缝合线表面出现明显的团聚现象,这是由ZIF-8@Cur溶液质量浓度过高导致的。

图5 涂层前后真丝缝合线的SEM图Fig.5 SEM images of the silk sutures before and after coating

2.2.2 涂层前后真丝缝合线的化学结构

图6 S,S/PDA和S/ZC15的红外光谱和X射线光电子能谱Fig.6 FTIR and XPS of the S,S/PDA and S/ZC15

2.2.3 真丝缝合线的药物上载量

真丝缝合线的药物上载量如图7所示。由图7可知,不同ZIF-8@Cur质量浓度处理后的真丝缝合线载药量随着质量浓度的增大依次提高,其中S/ZC1为(2.12±0.22)μg,S/ZC5为(2.76±0.26)μg,S/ZC10为(5.12±0.41)μg,S/ZC15为(14.92±1.29)μg,S/ZC20为(21.08±1.09)μg,样品S/ZC15 和S/ZC20有显著性提高,但由图5(f)可知,高质量浓度的MOF在缝合线表面会形成团聚,影响缝合线的应用,因此选择较高药物上载量和涂层均匀的S/ZC15。

图7 真丝缝合线的药物上载量Fig.7 Drug load of silk sutures

2.2.4 涂层前后真丝缝合线的力学性能

涂层前后真丝缝合线的直径如表2所示。由表2可知,未涂层缝合线S的直径为(300.4±7.0)μm,涂层后缝合线的直径未有显著性提高,这说明涂层不会改变缝合线的线径,缝合线规格仍属于2-0 。

表2 涂层前后真丝缝合线的直径Table 2 Diameter of silk sutures before and after coating

涂层前后真丝缝合线的断裂强力-应变曲线和打结断裂强力-应变曲线如图8所示。由图8可知,未涂层缝合线S的拉伸断裂强力为(27.36±0.51)N,断裂伸长率为(17.16±0.56)%;打结断裂强力为(18.40±0.57)N,断裂伸长率为(10.72±0.37)%;涂层后的缝合线断裂强力未有显著性变化,S/ZC20的断裂强力为(25.11±1.75)N,断裂伸长率为(16.28±1.86)%,较未涂层缝合线S略有下降,这是因为高质量浓度的MOF涂层会影响缝合线表面的粗糙度,形成大块的团聚,这些结构会影响缝合线的断裂强力和断裂伸长率。缝合线的打结断裂强力是评价缝合线力学性能的重要指标,如图8(d)所示,涂层前后缝合线的打结断裂强力未有显著性变化,均符合YY 0167—2020《非吸收性外科缝线》行业标准(图8(d)中虚线)。

图8 涂层前后真丝缝合线的力学性能Fig.8 Mechanical properties of silk sutures before and after coating

2.3 载药MOF涂层真丝缝合线的抗菌性能

为探究S/ZC15的抗菌性能,采用琼脂平皿扩散法测试涂层前后缝合线对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用,结果如图9所示。由图9可知,改性前的缝合线S对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均没有抑制作用,而S/ZC15可观察到清晰的抑菌圈,其对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌带宽度分别为(2.20±0.05)和(2.09±0.08)mm,参照GB/T 20944—2007《纺织品 抗菌性能的评价 第1部分:琼脂平皿扩散法》,抗菌效果评价中抑菌带大于1 mm没有细菌繁殖,这说明S/ZC15涂层缝合线具有良好的抗菌性能。

图9 S和S/ZC15真丝缝合线的抗菌性能Fig.9 The antibacterial activity of S and S/ZC15 silk sutures

2.4 载药MOF涂层真丝缝合线的细胞相容性

人包皮成纤维细胞HFF-1与S/ZC15缝合线共培养1,3,7 d的细胞增殖率如图10所示。由图10可知,7 d内人包皮成纤维细胞都呈显著性增加趋势,第一天S/ZC15缝合线细胞增殖率与空白对照组相比没有显著差异,第五天和第七天S/ZC15缝合线的增殖率为137.36%和388.48%,较空白组细胞增殖率分别下降17.84%和40.78%,这表明缝合线有很好的细胞相容性,有望在临床上得到进一步应用。

图10 人包皮成纤维细胞HFF-1与缝合线共培养增殖率Fig.10 Proliferation of the HFF-1 cells co-cultured with the sutures

3 结 论

(1)通过溶剂合成法成功制备了载药MOF ZIF-8@Cur,结果显示,ZIF-8@Cur的形貌规则,载药量为8.519%,包封率为70.29%。

(2)通过编织工艺制备了2-0型真丝缝合线,经多巴胺改性处理后,通过调控ZIF-8@Cur溶液的质量浓度,探究不同质量浓度ZIF-8@Cur溶液对真丝缝合线的化学结构、表面形貌、力学性能和药物上载量的影响,选出 ZIF-8@Cur涂层的最佳质量浓度为15 mg/mL,涂层处理后真丝缝合线表面涂层均匀、力学性能良好。

(3)抗菌试验证明,制备的S/ZC15真丝缝合线对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌有良好的抗菌效果。细胞相容性试验结果显示,S/ZC15真丝缝合线具有良好的生物相容性,在修复感染性伤口中具有潜在的应用价值。