基于网络药理学和分子对接技术探讨盐肤木治疗冠心病的作用机制*

陈家鑫 肖冰颖 郑 涛 林小惠 陈子春 林敏华

1 宁德师范学院附属宁德市医院药学部,福建省宁德市 352100; 2 宁德师范学院闽东畲药有效成分研究协同创新中心; 3 福建医科大学研究生院; 4 宁德师范学院医学院

冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary heart disease,CHD)是指由于冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄或闭塞导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病[1],简称冠心病,且其死亡率依然居高不下[2]。

畲药是畲族人民通过长期与疾病斗争中总结出的医药瑰宝[3]。盐肤木(Rhus chinensis Mill.)系畲族常用药材,畲药名为盐芋根,临床用于治疗冠心病[4]。目前鲜见关于盐肤木治疗冠心病作用机制的研究报道,大多聚焦于对盐肤木化学成分的分离鉴定以及粗提液的药理活性研究,其治疗冠心病的有效成分和作用机制尚不明确。

本研究拟通过网络药理学和分子对接的方法,探究盐肤木治疗冠心病的关键活性成分、核心作用靶点及相关信号通路,为畲药科学内涵提供参考,以期促进盐肤木的二次开发与推广应用。

1 资料与方法

1.1 盐肤木主要活性成分获取及筛选 基于文献资料[5]获取盐肤木治疗冠心病的主要活性成分,利用SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch/index.php/)检索活性化合物药物代谢信息,并以类药性中至少有两个yes且GI absorption为high作为主要评价指标,筛选盐肤木治疗冠心病的潜在药效成分。

1.2 盐肤木主要活性成分作用靶点预测 通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载盐肤木主要活性成分的SMILES结构文件,并上传至Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)数据库,以Probability>0为主要筛选参数,收集盐肤木主要活性成分的潜在作用靶点。

1.3 冠心病相关靶点获取 以“coronary heart disease”为关键词检索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)、Pharm GKB数据库(https://pharmgkb.org/),以及NCBI数据库(https://ncbi.nlm.nih.gov/)获取冠心病的相关靶点,将以上数据库得到的所有靶点合并后去除重复靶点,得到冠心病相关的疾病靶点基因。

1.4 “成分—靶点”网络构建 利用“VennDiagram”R 4.1.3语言包将盐肤木主要活性成分的潜在作用靶点与冠心病相关疾病靶点取交集,获得盐肤木治疗冠心病的潜在作用靶点并绘制韦恩图。将活性化合物及交集靶点导入Cytoscape 3.9.2中,构建盐肤木活性成分—靶点网络图。使用CytoHubba插件进行拓扑参数分析,以度值(Degree值)为评价参数,筛选盐肤木治疗冠心病的关键活性化合物。

1.5 蛋白互作网络构建 将交集靶点输入至STRING数据库(https://cn.string-db.org/),设置筛选参数为:(1)生物种类为“Homo sapiens”;(2)置信度>0.96;其余参数保持默认值不变,隐藏网络中无关联节点,构建蛋白质—蛋白质相互作用关系(Protein-Protein interaction,PPI)网络图。所得结果导入Cytoscape软件,通过Cytoscape-CytoNCA进行拓扑分析,筛选盐肤木治疗冠心病的关键靶点,按Degree值对核心靶点进行排序。

1.6 KEGG通路富集分析与GO功能富集分析 基于DAVID(https://david.ncifcrf.gov/,DAVID 6.8)数据库进行盐肤木治疗冠心病的潜在作用靶点的京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析和基因本体(Gene ontology,GO)功能富集分析,限定物种为“Homo sapiens”,以筛选出关键靶点的重要分子功能或信号通路。并使用R 4.1.3根据所得结果绘制柱形图、气泡图等。

1.7 分子对接 利用药物分子靶点PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得盐肤木活性成分的三维结构,利用蛋白质结构PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获得核心靶点蛋白的三维结构。根据以下条件进行筛选:(1)生物种类为“Homo sapiens”;(2)通过X射线衍射得到蛋白质结构;(3)蛋白质的晶体分辨率<3 Å(1Å=10-10m)。AutoDock 1.5.6分子对接软件实现靶点蛋白加氢、加电荷等处理,通过Autogrid 4插件设置网格框坐标,蛋白设置为刚性、配体设置为柔性进行对接,计算结合能。采用PyMol 2.3.2软件可视化展示分子对接结果。

2 结果

2.1 盐肤木主要活性成分筛选及其作用靶点 本研究通过文献得到盐肤木成分化合物46个,设置“类药性5项指标符合2项yes及以上且GI absorption为high”作为筛选条件,最终获得主要活性化合物16个,见表1。而后利用Swiss Target Prediction数据库查询盐肤木主要活性化合物的调控靶点信息,汇总取并集后共筛选出对应的作用靶点397个。

表1 盐肤木主要活性化合物

2.2 盐肤木治疗冠心病的潜在靶点预测 在GeneCards、NCBI、OMIM、DrugBank和PharmGKB数据库中分别检索到7 426、427、339、68和64个冠心病的潜在靶点,去掉808个重复靶点后,获得7 516个冠心病相关靶点。将盐肤木主要活性成分调控的靶点与疾病靶点取交集,获得276个潜在治疗靶点,见图1。

图1 盐肤木与冠心病交集靶点韦恩图

2.3 盐肤木活性成分—靶点网络构建 运用Cytoscape 3.9.2软件构建“成分—靶点”可视化网络(见图2),网络共166个节点,602条边。图中圆形节点表示靶点,菱形节点代表候选化合物,而边表示靶点与化合物的相互作用关系,度值表示该节点所连接边的数量,度值越大提示节点枢纽性越强。因此,以度值为评价参数,筛选盐肤木治疗冠心病的核心成分,结果显示Caffeic acid(咖啡酸)、Butin(紫铆素)、Phloretin(根皮素)、Ellagic acid(鞣花酸)、Quercetin(槲皮素)等化合物在整个网络中发挥关键调控作用,可能是盐肤木治疗冠心病的关键活性成分。

图2 盐肤木治疗冠心病的“成分—靶点”网络图

2.4 盐肤木与冠心病交集靶点PPI网络构建 在STRING平台将276个交集基因进行PPI网络分析,将数据导入Cytoscape 3.9.2实现网络可视化处理,见图3。网络共有207个节点,712条边,黄色节点为Degree值较高的关键靶点,结果显示潜在作用靶点之间具有良好的关联性。通过Cytoscape-CytoNCA拓扑分析筛选核心靶点,拓扑参数分析见表2,可视化结果见图4。节点大小、颜色深浅与Degree值呈正相关。节点越大,颜色越深,则Degree值越高,表明在PPI网络中发挥重要的联系作用。结果显示,Degree值排名前10位的核心靶点依次为SRC、HSP90AA1、STAT3、MAPK1、PIK3R1、AKT1、PIK3CA、EGFR、EP300、ESR1,提示以上蛋白可能是盐肤木治疗冠心病的关键作用靶点。

图4 拓扑分析核心靶点网络图

表2 PPI网络核心靶点拓扑参数分析

2.5 GO和KEGG富集分析 基于R 4.1.3使用Bioconductor生物信息软件包运行GO功能与KEGG通路富集分析。GO功能富集分析结果显示,交集基因集合共富集2 600条生物过程,涉及氧化应激反应、对氧含量的反应、MAPK级联的正调控等;共富集110条细胞组分,涉及膜筏、膜微区、细胞顶端等;共富集282条分子功能,涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性等。将P<0.05作为筛选条件,各选取排名前10的条目绘制柱状图(见图5左)。同时,KEGG信号通路富集分析共获得171条富集结果,根据基因命中数和P值从中选取排名前20的通路,结果显示盐肤木治疗冠心病主要涉及PI3K/Akt信号通路(PI3K/Akt signaling pathway)、神经活性配体—受体相互作用(Neuroactive ligand-receptorinteraction)、脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)以及钙信号通路(Calcium signaling pathway)等(见图5右)。

图5 GO功能富集分析(左)及KEGG通路富集分析(右)

2.6 分子对接 分子配体与受体结合能越低,构象越稳定,发生相互作用的可能性也越大。一般认为结合能≤-5kJ/mol,分子对接结构稳定,有较好的结合活性,若<-7kJ/mol则有强烈的结合活性。根据拓扑分析结果对筛选出的核心成分与核心靶点进行分子对接,结果见表3。结果显示盐肤木中的核心化合物与PPI核心靶蛋白结合能均<-5kJ/mol。除Caffeic acid-AKT1对接模型中不存在氢键,其余模型均存在分子间氢键,配体与受体形成氢键数目越多,其构象越稳定。其中Quercetin-AKT1、Ellagic acid-AKT1、Quercetin-SRC、Ellagic acid-SRC,Phloretin-STAT3、Butin-STAT3结合活性较好,具体对接模式见图6。

图6 6个最优的核心成分—靶点结合模式图

表3 核心成分与核心靶点分子对接结果

3 讨论

盐肤木是闽产特色畲族药材,最早记载于《山海经》,其根、叶、花及果均可入药,单味即可成方。现代药理研究表明,盐肤木根提取物能显著改善冠心病。本研究采用网络药理学对盐肤木治疗冠心病的核心成分、作用靶点与相关通路进行挖掘,探究其可能的分子机制及药效物质基础,并采用分子对接技术进行初步验证。最终筛选盐肤木治疗冠心病的核心成分5个与核心靶点3个,涉及GO功能条目3 000余条与KEGG通路条目171条,表明盐肤木治疗冠心病可能是多成分、多靶点、多通路协同作用的结果。

基于“成分—靶点”网络拓扑分析,提示咖啡酸、紫铆素、根皮素、鞣花酸和槲皮素等可能是盐肤木治疗冠心病的主要活性成分。其中,咖啡酸与鞣花酸属于酚酸类成分,紫铆素、根皮素、槲皮素属于黄酮类成分,由此推测盐肤木抗心肌缺血的药效物质基础可能为酚酸类和黄酮类,这与既往药理研究结果基本吻合。咖啡酸是植物体内广泛分布的次级代谢产物,可提高心肌缺血大鼠模型的心脏射血分数,显著提高短轴缩短率,抑制心肌纤维化,其机制可能与抑制巨噬细胞炎症有关。鞣花酸为一类天然多酚类化合物,是没食子酸的二聚衍生物,通过抑制炎症、减轻氧化应激、减少血小板聚集、改善脂代谢来发挥抗心肌梗死作用,研究表明其可激活p-AMPK,调节下游蛋白p-mTORC1及p-p70S6K的表达,从而保护心肌免受脂毒性损伤[6-7]。紫铆素又名漆黄素,为黄酮多酚化合物,在多种疾病中表现出抗炎、抗氧化应激和抗血管生成的特性,可通过激活Nrf2/ARE信号通路,显著减轻缺血再灌注诱导的心肌损伤,对氧化应激诱导的线粒体功能障碍具有显著保护作用[8]。根皮素属于黄酮类家族中的二氢查耳酮,可抑制Akt/NF-κB信号通路,降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子水平,并通过直接与Keap1蛋白结合,促使Nrf2从Nrf2-Keap1复合物上解离活化,上调机体抗氧化酶SOD、GSH活性,发挥预防心肌炎症、氧化应激和纤维化反应的保护作用[9]。槲皮素作为分布和研究最广泛的多羟基黄酮类化合物之一,具有多个氧化还原中心,是一种优良的天然抗氧化剂,在预防和治疗冠心病方面具有巨大潜力,其中涉及减弱氧化应激反应、抑制中性粒细胞炎性浸润、影响脂代谢途径等多种机制的交互作用[10-12]。由此可见,本研究所预测的盐肤木治疗冠心病的核心成分均具有心血管保护活性潜能,与其广泛参与炎症反应、氧化应激及脂代谢等机制调控息息相关,且部分已得到实验验证,进一步佐证盐肤木治疗冠心病的药效物质基础。

基于PPI网络拓扑分析,发现AKT1、SRC、STAT3处于中心枢纽位置,可能是其关键性作用靶标。AKT1是目前所发现的3种AKT蛋白亚型之一,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在多种组织中广泛表达,与心血管功能调节关系密切,活化后可调控其下游靶基因,如内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Bcl-2相关细胞死亡促进因子(BAD)等,进而促进一氧化氮的合成与释放[13]、抑制细胞自噬进程[14],参与调节心肌梗死后的心律失常、心肌重塑及血管新生。SRC是一类非受体酪氨酸激酶,可通过非经典途径诱导关键酪氨酸残基磷酸化,调节下游AKT、STAT3、MAPK等靶标的活性,从而广泛参与氧化应激、炎性反应、心肌纤维化等冠心病相关的重要病理环节[15-16]。STAT3作为STAT家族最早发现的转录激活因子,是一种在多组织器官中表达的急性反应性因子,也是体内多类信号级联通路的交汇点[17-18]。STAT3通过介导生存活化因子增强途径(FOXO1、BAD、Caspase-3等)及再灌注损伤修复激酶途径(PI3K、PKB、GSK-3β等),拮抗心肌细胞坏死、缺血再灌注损伤、心肌肥厚等,继而发挥心血管保护作用[19]。此外,酪氨酸激酶型受体EGFR与雌激素受体ESR1被普遍视为PI3K、SRC、MAPK通路的上游信号;分子伴侣HSP90AA1可协助维持SRC激酶结构稳定、与肌动蛋白相互作用增强AKT活性等。综上,所预测核心靶点均具有作为心血管疾病特异性靶点的潜能,且围绕AKT1、SRC、STAT3发生样式丰富的交叉对话,说明盐肤木可能通过以AKT1、SRC、STAT3为关键核心、多种信号分子为辅助的复杂调控网络发挥防治冠心病的作用。为验证网络药理学结果,基于分子对接技术,从分子空间结构与能量匹配角度,证实活性成分咖啡酸、紫铆素、根皮素、鞣花酸、槲皮素与核心靶蛋白AKT1、SRC、STAT3具有很强的亲和力且结合较为稳定,为核心成分与核心靶蛋白的潜在相互作用提供进一步证据,提示盐肤木可能通过咖啡酸、紫铆素、根皮素、鞣花酸、槲皮素作用于AKT1、SRC、STAT3等靶点发挥抗心肌缺血疗效。

本研究基于网络药理学和分子对接的方法,初步阐明盐肤木防治冠心病的药效物质基础及潜在作用机制。研究结果显示,盐肤木治疗冠心病的潜在活性成分有咖啡酸、紫铆素、根皮素、鞣花酸、槲皮素等,核心靶点有AKT1、SRC、STAT3等,潜在作用机制为通过调控PI3K/Akt通路等干预疾病发生发展,并证明潜在活性成分与核心靶点间具备交互潜能。上述研究基于公共数据库及计算机模拟技术论证了盐肤木是通过多成分、多靶点、多通路发挥治疗冠心病的作用。预测的结果尚未进行相关实验验证是本研究的主要局限性,今后需在此理论基础上进行实验论证,明确其精细的药理调控机理。