响应面法优化地花活络酒的制备工艺

刘舒雅 陈健明 吴爱梅 柯颖标

跌打损伤是骨伤科临床常见病种，多因强力外袭，局部筋脉肌肉受损，脉络不利，气血瘀滞等所致，主要临床表现为局部疼痛、肿胀青紫、关节肌肉疼痛。本病属中医“伤筋”范畴，主要采用活血化瘀、活络通经、祛风除湿、消肿止痛等中药予以治疗。西医主要以甾体抗炎免疫药、非甾体抗炎免疫药、合成类固醇等抗炎止痛药物治疗，但该类药物副作用较大，患者耐受程度低，不宜长期服用[1-2]。中医治疗跌打损伤历史悠久，古称“跌打损伤”为诸伤之总论。地花活络酒由熟地黄、鸡血藤、红花等12 味中草药组成，具有活血化瘀、祛风除湿、快速止痛功效，可外涂或配合本院制剂金黄散和风湿散使用，用于治疗颈椎病、风湿性关节炎、腰肌劳损、骨质增生等多种疾病。经过几十年的观察地花活络酒在骨伤的临床治疗中发挥了显著的作用，在目前的剂量、疗程范围内用药安全，无毒副作用，是治疗跌打损伤疼痛安全有效的药物。然而，与大多数民族传统制剂相同，地花活络酒的制备工艺较原始，缺乏科学的质量评价标准，药理作用、有效成分、工艺条件、质量检测等方面均没有进行深入研究，极大地限制了其的发展和应用[3-4]。因此，本研究拟采用响应面法优化地花活络酒的制备工艺，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken 响应面分析法和Design-Expert 13 软件，考察浸泡时间、搅拌次数、药材粉碎粒度3 个因素对总固体物量的影响[5-8]，得出最佳的工艺参数，确定地花活络酒的质量评价标准。

1 材料与方法

1.1 材料

地花活络酒的处方组成：熟地黄12 g，桂枝4 g，独活1 g，杜仲4 g，红花1 g，羌活1 g，骨碎补4 g，五加皮8 g，鸡血藤16 g。实验所用的中药饮片皆来源于茂名市中医院中药房。

1.2 试剂与仪器

电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司，型号：FA2004B），智能数显电热鼓风干燥箱（上海成顺仪器仪表有限公司，型号：JC101），数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司，型号：HH-6）。

1.3 方法

1.3.1 地花活络酒的制备流程将以上9 味药材，置容器内，加入50 度白酒1 000 ml，密闭浸泡15 d，滤过，即得。

1.3.2 总固体物量的测定方法分别精密吸取各样品上清液100 ml，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，放置于水浴上蒸干，在105 ℃下干燥3 h，移置干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量。

1.3.3 实验流程设计1）单因素分别考察浸泡时间、搅拌次数、药材粉碎粒度3 个因素，对总固体物量的影响。2）以总固体物量为考察指标，依据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，并结合单因素试验结果，运用Design Expert 13 软件设计响应面试验，进行三因素三水平17 个试验点的响应面试验分析，从中优选地花活络酒的提取工艺[9-10]。3）工艺验证，通过Design-Expert 13 软件求解回归方程得到总固体物量的最佳提取条件，结合生产的实际条件，计算实际总固体物量和理论预测值的误差。

1.3.4 单因素试验设计单因素考察：与浸泡工艺相关的考察因素有多种，实验初期选择了白酒浓度、浸泡时间、搅拌次数、药材粉碎粒度作为考察因素，在实际试验中发现白酒浓度低于50 度时，样品微生物限度检测结果变化较大，质量不可控，所以剔除白酒浓度作为单因素考察，固定白酒浓度为50 度。

1）浸泡时间考察：按处方比例称取各药材，加入50 度白酒1 000 ml，分别浸泡10、15、20、30、40、50 d，每10 天搅拌2 次。因此，浸泡的水平选取20、30、40 d 进行后续Box-Behnken 试验考察。2）药材粉碎粒度考察：按处方比例称取各药材，分别将药材饮片打粉成粗颗粒（花生粒大小，5～10 mm）、最粗粉（2 mm）、粗粉（0.85 mm）、中粉（0.25 mm），加入50 度白酒1 000 ml 浸泡15 d，每10 天搅拌2次，考察不同粉碎粒度对总固体物量的影响。药材粉碎粒度的水平选取粗颗粒、最粗粉、粗粉进行后续Box-Behnken 试验考察。3）搅拌次数：按处方比例称取各药材，加入50 度白酒1 000 ml，浸泡15 d，每10 天分别搅拌1、2、3、4、5 次，测定总固体物量。搅拌次数的水平选取 2、3、4 进行后续Box-Behnken 试验考察。

1.3.5 Box-Behnken 响应面试验选择最佳提取条件响应面法试验设计和优化：在单因素试验基础上，选取浸泡时间（A）、药材粉碎粒度（B）、搅拌次数（C）为考察因素，以总固体物量为响应值，运用Design Expert 13 软件设计响应面试验，进行三因素三水平设计。因素水平见表1。

表1 Box-Behnken 响应面试验因素与水平

2 结果

2.1 单因素试验

2.1.1 浸泡时间对总固体物量的影响浸泡30、40、50 d 时，浸渍出的总固体物量较多，但得率相差不明显。因此，浸泡的水平选取20、30、40 d 进行后续Box-Behnken 试验考察。见图1。

图1 浸泡时间对总固体物量的影响

2.1.2 药材粉碎粒度对总固体物量的影响药材粉碎越细，总固体物量越大，在最粗粉出现最大值，此后数据下降。见图2。

图2 药材粉碎粒度对总固体物量的影响

2.1.3 搅拌次数对总固体物量的影响随着每周搅拌次数越多，总固体物量呈上升趋势，每10 天搅拌3 次处达到最大值，此后数据差异较小。见图3。

图3 搅拌次数对总固体物量的影响

2.2 Box-Behnken 响应面法优化地花活络酒的制备工艺

2.2.1 响应面模型设计方案及试验结果17 次试验中，总固体物量最小值为1.138 9，最大值为1.230 7。见表2。

表2 Box-Behnken 响应面试验设计与结果

2.2.2 响应面模型建立与显著性检验通过Design-expert 13 软件对实验结果进行分析，见表3，得出回归方程Y=1.21+0.008 4A+0.025 1B+0.015 7C+0.003 9AB+0.002 1AC-0.001 6BC-0.002 5A2-0.008 9B2-0.014 6C2，R2=0.968 7。F=24.04，P=0.000 2＜0.05，表明回归模型差异有统计学意义；失拟项是用来表示模型与实验拟合的程度，本实验的失拟项F=24.04，P=0.967 6＞0.5，表明该模型拟合良好，模型的残差可能是随机误差产生的，模型与实际值能较好地拟合。

表3 Box-Behnken 响应面试验方差分析结果

该模型中A、B、C、B2、C2均为显著项（P＜0.05），显著程度B＞C＞A，说明粉碎粒度对响应值的影响最大，搅拌次数其次，浸泡天数最末。

响应面交互作用分析：在浸泡时间、搅拌次数、药材粉碎粒度3 个影响因素中，取任意两个因素分别作为X轴和Y轴，以综合评分作为Z轴，采用Design-Expert 软件创建两因素交互作用对综合评分影响的三维响应面图（图4）。等高线的形状可反映交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆表示两因素交互作用显著；影响因素的显著水平和响应面图的曲面性状相关联，曲面越陡峭，说明该因素对响应值的影响越大。由图4B 可得，总固体物量随着搅拌次数、浸泡天数的增加而升高，其响应面图形表现得相对陡峭，且等高线轮廓近似椭圆形，表明两因素间的相互作用相对较强。

图4 两因素交互作用对总固体物量影响的三维响应面图和等高线图

2.3 验证实验结果

通过Design-Expert 13 软件求解回归方程得到总固体物量的最佳提取条件为浸泡时间40 d、粗粉、每10 天搅拌3.555 次，在此提取条件下所得总固体物量为1.237 g。按处方比例称取各药材，浸泡40 d，把药材粉碎为粗粉，每10 天搅拌4 次。平行3 次试验所得总固体量为1.234 5 g、1.231 7 g、1.229 7 g，平均值1.232 0 g（RSD=0.20%），表明建立的模型和实际情况基本吻合。

3 讨论

地花活络酒由养阴补肾、活血通经、祛瘀止痛的熟地黄和红花作为君药，辅助温通经脉、祛风除湿的桂枝、独活、羌活，具有活血化瘀、祛风除湿、快速止痛的功效。响应面分析法系采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，进行多因子试验，将各个因素与指标的相互关系用多项式拟合，通过软件计算对函数的响应面和等高线进行分析，计算可得出因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系。响应面分析法通过连续的试验方法，建立实证模型，Design-Expert 13 软件得出的回归方程精度高，对比其他点对点单一的优化方法，其优势是能够将优化过程延伸到面的程度，呈现立体效果，已广泛应用于医药、食品等多个领域中[11-13]。

本研究通过设计三因素三水平响应面分析法试验，得出粉碎粒度对总固体物量的影响最大，搅拌次数其次，浸泡天数最末：搅拌次数和浸泡天数这两个因素的相互作用对结果的影响最大。最后结合生产的实际情况最终确定提取最佳工艺参数：浸泡时间为40 min，把药材粉碎为粗粉，每10 天搅拌4次。按照此工艺得到的总固体物量较高，为1.232 0，实际情况和响应面法回归模型高度拟合，说明该法优选的工艺稳定可靠。该研究结果对中药的综合利用以及中药制剂产业化具有理论指导意义。但地花活络酒是纯中药制剂，其成分复杂，药效一定条件下会互相转化和干扰[14-15]，因此，在未来的工作中还需进一步研究其有效物质的理化性质、构效关系等，才能使民族传统制剂逐步走向规范化、科学化和机械化，为人类健康做出更大贡献。