基于GC-MS代谢组学分析MK-801诱导精神分裂症大鼠血浆代谢特征

黄云霞 黄雪霞 文静

精神分裂症是一种严重而复杂的精神障碍，全球发病率约为1%［1］，主要表现为阴性症状、阳性症状及认知缺陷等［2-5］。精神分裂症多发于青春期且发病机制十分复杂，目前尚未完全阐明其发病机制。地佐西平（dizocilpine，MK-801）是一种N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDAR）非竞争性拮抗剂，国内外广泛用于诱导精神分裂症的动物模型的工具药［6-8］。然而，其诱导精神分裂症症状的机制也尚不完全清楚。代谢组学是研究内源性代谢物的方法，通过识别正常或病理代谢变化及相关的生化途径，挖掘分子机制和发现生物标志物，为探索疾病机制提供新的研究思路［9-10］。因此，本研究采用气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）的非靶向代谢组学方法，探讨MK-801诱导精神分裂症的大鼠血浆显著代谢物影响及相关代谢途径，为进一步探明精神分裂症的发病机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠20只，选购于北京维通利华实验动物技术有限公司；许可证编号：SCXK（京）2020-0005。饲养环境为：室温20 ～24 ℃，相对湿度15% ～ 55%，实验动物自由饮食，自然光照，通风良好。

1.1.2 药物与试剂 MK-801（德国Sigma公司，77086-22-7），L-2-氯苯丙氨酸（98%）（北京百灵威科技有限公司），硬脂酸甲酯（99.5%）（美国 Sigma-Aldrich 公司），甲氧胺盐酸盐（99%）（北京百灵威科技有限公司），BSTFA+1%TMCS （98%）（北京Solarbio科技有限公司），乙腈（色谱纯）（美国Thermo Fisher 公司）；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器设备 气相色谱-质谱联用仪7890A-5975C（美国Agilent公司）；冷冻研磨仪 JXFSTPRP-CL（上海净信实业发展有限公司）；高速冷冻离心机STR16R（美国Thermo Fisher 公司）；十万分之一电子天平 BSA124S-CW（德国Startorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模及行为学测试 20只雄性SD大鼠分为对照组（腹腔注射生理盐水，n=10）和试验组（腹腔注射MK-801制备精神分裂症大鼠模型，0.5 mg∕kg，n=10）［11］，每天上午9点给药1次，连续给药2周。最后一次给药后24 h依次参照文献方法［12-13］进行旷场（open field test，OFT）、高架十字迷宫（elevated plusmaze test，EPM）和新物体识别实验（novel object recognition test，NOR）对精神分裂样症状进行评价。OFT观察指标为总路程反映大鼠自主运动量（即中枢神经系统的状态兴奋或抑制）。EPM观察指标为大鼠进入开臂次数和在开臂停留时间（在开放臂的活动多少），用于评价大鼠的焦虑状态。NOR测试包括两个试验熟悉期（T1，探索两个相同物体）和测试期（T2，更换一个物体为新物体），通过识别新旧物体的时间评价大鼠的学习记忆能力。

1.2.2 溶液配制 准确称取 L-2-氯苯丙氨酸适量，配制成浓度约为 250 μg∕mL的 L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液作为内标1。准确称取甲氧胺盐酸盐适量，配制成浓度约20 mg∕mL甲氧胺盐酸盐吡啶溶液作为肟化试剂。准确称取硬脂酸甲酯适量配制成浓度约为 50 μg∕mL硬脂酸甲酯正庚烷工作液作为内标2。配制好的溶液均保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.3 血浆样品的制备 SD大鼠麻醉后，采集大鼠心血（约 0.5 mL）置于有肝素钠（12 500单位）离心管并离心，取澄清血浆于冻存管中保存。取样后迅速将样本置于液氮中，待全部取样完成后转移至-80 ℃冰箱中保持。

1.2.4 血浆样本的预处理 分别从两组7个解冻血浆样本中移取血浆约100 μL置于1.5 mL离心管中，加250 μg∕mL L-2-氯苯丙氨酸溶液20 μL混匀，加冰乙腈300 μL涡旋混匀，离心取上清液100 μL氮气挥干。于残渣中加 30 μL浓度为 20 mg∕mL 的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液，涡旋15 s后于 80 ℃烘箱中肟化 15 min，放冷后加 50 μL浓度为 50 μg∕mL 的硬脂酸甲酯庚烷溶液，涡旋，高速离心取上清 90 μL置于进样小瓶。

质控样本：取所有血浆样本各30 μL于5 mL EP管中混匀，制得质控（quality control，QC）样本。根据样本数量计算所需要质控样本数量，需要5个质控样本。取血浆质控样本100 μL于1.5 mL EP管中，加250 μg∕mL L-2-氯苯丙氨酸溶液20 μL混匀。加冰乙腈300 μL，其余操作同血浆样本。对照样本：取 100 μL冰乙腈于 1.5 mL EP管中，加入 250 μg∕mL的 L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液 20 μL，其余操作同血浆样本。

1.2.5 CG-MS 仪器条件

1.2.5.1 色谱条件 DB-5MS型号毛细色谱柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；载气：高纯He气流速：1.0 mL∕min；进样口温度：250 ℃；辅助加热器温度：230 ℃；进样方式：不分流进样；程序升温：起始温度60 ℃，保持1 min，8 ℃∕min升至300 ℃，最后保持7 min，进样程序需38 min。质谱条件四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，电子轰击电离（electron impact， EI）方式，电离能量70 eV，溶剂延迟4.5 min，全扫描模式（SCAN），扫描范围M∕Z 50～600 amu。

1.2.5.2 进样条件 自动进样器进样，进样体积 2 μL，检测样本前先进行内标、空白以及 QC 样本进样（连续3个）。在整个分析检测过程中，每进7个样本安插进1个 QC样本。内标用于确定色谱峰的位置，空白用于排除外源性物质干扰，QC 用于考察 GC-MS 分析检测过程中的稳定性。

1.2.6 血浆代谢物筛选 血浆样本经过前处理及GC-MS分析后，色谱图经过 AMDIS 6.51 软件及NIST14 数据库（安捷伦科技，美国）进行去卷积及色谱峰识别，匹配度＞80%的色谱峰为可定性代谢物，导出数据至 EXCEL，色谱信息包含化合物名称、保留时间及峰面积。

将用于定性的所有代谢物的峰面积均除以 L-2-氯苯丙氨酸（内标 1）的峰面积得到代谢物的相对浓度，同时删除 QC 样本中相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）大于 30%的物质，将剩余部分的数据处理成矩阵的形式。

1.2.7 血浆差异代谢物筛选 数据导入Metaboanalyst 4.0 数据库中进行多元统计分析。首先采用主成分分析法（principal components analysis，PCA）分析，观察包括 QC 在内的各组间区分度及组内聚集情况，初步评价实验的组内和组间差异是否明显，并通过 QC 样本的聚集情况判断样本分析的总体质量。然后通过偏最小二乘法-判别式分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）分析MK-801组与对照组之间的效果，根据变量投影重要度（variable importance in the projection，VIP），VIP 值大于 1，t检验P值小于0.05 筛选差异代谢物。

1.2.8 血浆差异代谢物通路分析 将上述统计学分析筛选出的差异代谢物导入Metaboanalyst 4.0数据库的“通路分析”模块进行通路分析。通路分析参数：通路数据库为Rattus Norvegicus（rat）；通路富集分析算法为超几何检验（hypergeometric test）；拓扑分析算法为相对中介中心性（relative-betweeness centrality）。通路分析结果中，P值小于0.05的通路认定为显著改变的代谢通路。

3 结果

3.1 行为学检测 OFT实验结果显示，与对照组相比，试验组大鼠运动距离显著降低（图1A）。EPM实验结果显示，试验组大鼠在进入开臂的次数和在开臂持续的时间较对照组显著降低（图1B、1C）。NOR实验结果显示，在熟悉期（T1）对照组和试验组大鼠对两个相同物体探索时间均无显著差异；在测试期（T2）对照组大鼠对新物体探索时间较熟悉物体显著增加（P＜0.05），而试验组大鼠对新物体探索时间较熟悉物体没有显著差异。见表1。以上结果提示，试验组大鼠精神分裂症模型制备成功。

表1 新物体识别实验头部探索时间统计（）

表1 新物体识别实验头部探索时间统计（）

注：与大鼠识别熟悉物体时间相比，对照组和试验组大鼠识别新物体的时间，①P＜0.05。物体1和2为两个相同物体。

测试物体1物体2 F值P值熟悉期（T1）（s）对照组10.65±3.63 9.89±4.83 1.457 0.7719试验组5.82±6.35 3.79±4.57 1.931 0.575试验组5.99±4.18 8.17±4.16 1.009 0.4288测试熟悉物体新物体F值P值测试期 （T2） （s）对照组7.01±10.15 33.53±16.97①2.796 0.0134

图1 OFT和EPM实验

3.2 血浆代谢物筛选结果 与NIST14谱库比对，匹配度＞80%为定性标准，分别在QC样本中定性出80种代谢物。见图2。

图2 血浆样本GC-MS总离子色谱图

3.3 血浆差异代谢物筛选结果 PCA分析结果如图3A所示，对照组与试验组有部分重合，QC样本聚集较好。PLS-DA分析显示，两组样本能有效区分（图3B）。交叉验证模型变量结果R2=0.864 72，Q2=0.775 38。以VIP 值大于1和t检验P值小于0.05为标准筛选差异代谢物结果见表2，试验组与对照组相比共筛出10种差异代谢物，其浓度变化均呈下降趋势。

表2 血浆样本差异代谢物

图3 两组样本PCA和PLS-DA得分图

3.4 血浆差异代谢物的通路分析 差异代谢物代谢通路分析结果见表3。血浆差异代谢物主要参与氨酰-tRNA生物合成和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代谢。即苯丙氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸参与氨酰-tRNA生物合成代谢通路；苯丙氨酸、酪氨酸参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代谢。

表3 血浆代谢通路信息表

4 讨论

精神分裂症是一种严重的精神疾病，发病机制复杂，已经成为全球卫生资源的沉重负担。然而，精神分裂症的病因和机制仍未阐明。精神分裂症研究公认的药理模型是NMDA受体的非竞争性拮抗剂（MK-801和氯胺酮），因此本研究参照文献［11］方法采用MK-801给药，模拟大鼠的精神分裂症样行为，构建了精神分裂症的大鼠模型。通过代谢组学的技术探索MK-801诱导类似精神分裂症模型大鼠体内内源小分子的代谢，挖掘与精神分裂症相关的特征性生物标志物及代谢途径，为精神分裂症病理提供新的见解。

自主活动、焦虑及认知障碍是精神分裂症的典型症状，分别用旷场、高架十字迷宫和新物体识别试验进行评价。在OFT中，与对照组相比，试验组大鼠自主运动显著降低。在EPM测试中，试验组大鼠进入开臂次数和在开臂持续的时间较对照组显著减少，表明MK-801慢性给药诱导大鼠焦虑样行为。NOR试验中模型大鼠识别能力较对照组显著降低，表明认知障碍。这与一项以MK-801构建精神分裂为模型进行治疗药物机制研究中的结果一致［14］。上述行为学结果表明采用MK-801给药成功构建实验性精神分裂症大鼠模型。

生物体代谢组的改变往往是受基因、疾病、环境、药毒物等多因素作用后的最末端反应，可以为寻找表型变化的“线索”［15］。本实验采用基于GC-MS的代谢组学检测方法对亚慢性MK-801给药后大鼠血浆样本进行检测，PCA分析结果显示QC样本聚集较好，提示GC-MS在样品分析过程中较为稳定，系统误差小；对照组与试验组有部分重合说明两组存在一定代谢物差异。PLS-DA分析结合交叉验证结果表明该模型可靠、拟合准确性好。经过差异代谢物筛选，试验组多种氨基酸浓度较对照组显著降低，包括苏氨酸、丝氨酸、肌氨酸、丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、柠檬酸、酪氨酸和色氨酸，其浓度均显著下降。提示MK-801诱导的精神分裂症可能导致血浆氨基酸代谢紊乱。

氨基酸是三羧酸循环的前体，影响蛋白质合成和能量代谢［16］。氨基酸代谢异常与多种神经精神障碍有关，包括自闭症谱系障碍［17］、智力残疾、癫痫［18］和精神分裂症［19］等。如谷氨酸和D-丝氨酸水平与抑郁症、精神分裂症和认知缺陷的严重程度呈负相关［20-22］，其中，谷氨酸能缺陷被认为是精神分裂症中常见的许多症状的基础，特别是阴性和认知症状。研究表明，谷氨酸和D-丝氨酸均是NMDAR激动剂，可以改变NMDAR的功能。而NMDAR对神经兴奋性传递、突触可塑性、学习和记忆［23］至关重要，NMDAR功能减退是精神分裂症的一个重要病因成分［21］。此外，氨基酸对于蛋白质合成、能量代谢和神经传递等代谢过程至关重要。本研究结果显示，MK-801引起大鼠血浆谷氨酸和丝氨酸水平的下降，表明MK-801扰乱二者体内代谢的稳态，进而影响NMDAR甘氨酸位点的底物代谢，导致NMDAR功能障碍，这与人类慢性精神分裂症患者中发现谷氨酸合成全面下调结果一致［24］。精神分裂症是复杂行为和精神心理的综合状态，可能与多条代谢通路有关。本研究发现了部分差异代谢物，并筛选出主要参与的相关代谢通路，其中显著改变的丝氨酸、色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸等可能成为与精神分裂症相关的潜在生物标志物，下一步将利用靶向代谢组学进行深入研究，希望能为精神分裂症相关机制的研究提供更进一步的基础。