β2肾上腺素能受体激动剂对低氧诱导肺动脉高压中肺血管重构及BMPR2/BMP4表达的影响

陈祖乔 王芳 李泽罡 尹涛源

(1三亚中心医院心内科, 海南 三亚 572000;2海南医学院基础医学与生命科学学院)

肺动脉高压(PAH)是一种具有高致死率的进行性肺血管疾病,其特征是肺动脉血管重构和肺血管阻力增加,最终导致右侧心室肥大和心力衰竭,甚至引起患者死亡〔1,2〕。其中,肺血管重构在PAH的发生发展过程中起着重要作用,主要表现为内侧增厚、肺动脉肌肉增强及肺动脉平滑肌细胞不受控制的增殖扩张〔3〕。近年来,尽管PAH的治疗取得了进展,主要通过使用包括内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂和前列环素类似物等对肺血管进行收缩以改善PAH症状〔4〕,但这种方法只能适度提高患者生存率,多数患者的预后仍然较差。因此,如何有效防治PAH现已成为临床上亟待研究并解决的一项关键内容。β肾上腺素能受体(βAR)是G蛋白耦联受体的一种,可作为正常生理条件下心肌收缩力调节的关键因子。β2AR是G蛋白耦联受体超家族的一员,广泛表达于平滑肌上,如血管平滑肌、支气管平滑肌、骨骼肌血管等,该受体与其激动药剂结合后可引起平滑肌舒张〔5〕。研究表明,在某些类型导致的心力衰竭中,β2AR丢失可能会失去正常的心脏保护特性〔6〕。此外,有报道指出β2AR受体激动剂对慢性阻塞性肺疾病患者的肺循环血流动力学和右室功能表现出有益作用,能够延缓疾病的发生和发展〔7〕。鉴于此,本研究通过低氧诱导构建大鼠PAH模型,以沙丁氨醇作为β2AR激动剂对PAH大鼠进行治疗,旨在探讨β2AR激动剂在PAH大鼠肺血管重塑中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康Sprague-Dawley大鼠40只,雄性,体质量180～200 g,由海南药物研究所有限责任公司提供,饲养于无特定病原体屏障环境,温度22～24 ℃,相对湿度为(50±5)%,12 h/12 h明暗交替,适应性喂养1 w后进行实验。本研究获得医院伦理委员会审批。

1.2主要试剂 β2AR激动剂沙丁氨醇(齐鲁制药),苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒和丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(南京建成生物公司),免疫荧光染色试剂盒和免疫组织化学染色试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司),二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒和增强型电化学发光(ECL)显色液(上海碧云天生物研究所),兔抗人肺组织增殖细胞核抗原(PCNA)多克隆抗体、鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(SMA)单克隆抗体、兔抗人骨形态发生蛋白(BMP)4多克隆抗体、兔抗人BMP受体(BMPR)2多克隆抗体和兔抗人Smad1/5/8多克隆抗体(英国Abcam公司),兔抗人磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物公司)。

1.3低氧诱导PAH模型的建立及分组 将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、β2AR激动剂低剂量组、β2AR激动剂高剂量组,每组10只。对照组饲养于常氧环境下,其余3组饲养于常压低氧箱内,氧浓度设置为(10.0±0.5)%,箱内放石灰钠和无水氯化钙,用以吸收过量的CO2和水分,连续3 w后,β2AR激动剂低、高剂量组分别通过腹腔注射2.5、5.0 mg/kg的沙丁氨醇,其他两组同时腹腔注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS),1次/d。连续2 w,期间各组均自由进食、饮水。

1.4肺动脉压的测量 给药结束后,腹腔注射10%水合氯醛注射液麻醉,以仰卧位固定于解剖台上,皮肤消毒,将导管经右颈外静脉插入,经右心房送入右心室(RV),固定导管,另一端导管与Power Lab电力生理信号数据采集系统连接,记录仪上观察右心室内压力波形,记录RV收缩压(RVSP)。

1.5RV肥厚指数的测量 RVSP测量结束后,预冷PBS灌流,迅速离体肺组织及心脏,分别分离RV、左心室(LV)及室间隔(S),电子分析天平称重,计算RV肥厚指数(RVH),公式:RVH=RV/(LV+S)。

1.6HE染色观察肺组织重构 将左侧肺组织置于4%甲醛溶液固定24 h,常规石蜡包埋,切片机上进行连续切片,制备成厚度为5 μm的组织切片。取组织切片,经过二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水,双蒸水洗涤,Mayer苏木素染色10 min,双蒸水洗涤,1%盐酸-酒精分化数秒,流水冲洗,再用双蒸水洗涤,0.5%伊红染色2 min,流水冲洗,程序化脱水与透明,中性树胶封固,在光学显微镜下观察肺组织形态学变化与重构,并摄取图像。

1.7肺组织内氧化应激相关指标的测定 将右侧肺组织用预冷生理盐水冲洗干净,无菌环境下剪碎,称取适量于离心管,加入适量RIPA裂解液,超声波细胞破碎仪充分磨碎,冰上静置10 min充分裂解,4 ℃低温离心机以12 000 r/min离心10 min,留取上清液,通过氮蓝四唑显色法检测SOD活性,硫代巴比妥酸法测定MDA含量,参照试剂盒说明操作。

1.8免疫荧光染色法检测肺组织PCNA表达 取制备的肺组织切片,经过二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后,PBS洗涤(5 min×3次,下同),微波炉高温(95 ℃)修复抗原,室温冷却后,以10%山羊血清室温封闭45 min,弃去多余血清,在切片上滴加经PBS稀释的兔抗人PCNA多克隆抗体(1∶100),4 ℃下孵育过夜。次日,PBS洗涤,滴加经PBS稀释的荧光素标记的二抗(1∶200),室温避光孵育2 h,PBS冲洗后,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育15 min,防淬灭封片剂封片,荧光显微镜观察荧光表达强度变化,并摄取图像。

1.9免疫组织化学染色测定肺组织α-SMA表达 取制备的肺组织切片,经过二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后,3%H2O2抑制内源性过氧化物酶室温处理20 min,PBS清洗后,用10%山羊血清室温封闭1 h,将切片与经PBS稀释后的鼠抗人α-SMA单克隆抗体(1∶100)置于4 ℃下共孵育过夜。次日,PBS洗涤,切片上滴加经PBS稀释的酶标记的二抗(1∶1 000),室温孵育1 h,PBS洗涤。利用DAB试剂液显色,流水冲洗,苏木素复染,程序化脱水与透明,中性树胶封固,在光学显微镜下观察肺组织切片内染色情况,并摄取图像,阳性着色为胞质或胞核呈棕黄色至棕褐色,每张切片随机选择5个不同视野,Image-Pro Plus6.0软件统计阳性染色的平均光密度值。

1.10Western印迹检测肺组织BMP4/BMPR2途径相关蛋白表达 取右侧肺组织研磨匀浆后,提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度,使用裂解液将各样品浓度进行归一化处理。制备10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶,取50 μg蛋白上样,进行凝胶电泳分离蛋白,再以200 mA恒流转膜,将分离的目的蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,将膜与5%脱脂奶粉封闭液共封闭1 h,再分别浸于PBS稀释的一抗液(1∶1 000)中,4 ℃孵育过夜。次日,Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)洗膜(10 min×3次,下同),常温下将膜与经PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)共同孵育 1 h,TBST再洗膜。利用增强型ECL显色液在暗箱内进行显影,凝胶成像系统拍摄图像,Image-Pro Plus6.0软件分析各目的蛋白及内参蛋白GAPDH的灰度值,以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.11统计学分析 采用GraphPad8.30软件进行单因素方差分析和LSD法检验。

2 结 果

2.1各组肺动脉压力及RVH对比 与对照组比较,模型组RVSP和RVH显著增加(P<0.05)。与模型组比较,β2AR激动剂低、高剂量组RVSP和RVH均显著降低(P<0.05)。而β2AR激动剂低、高剂量组RVSP和RVH差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2各组肺组织HE染色 对照组肺组织结构完整,管壁周围未见明显的炎症细胞浸润;与对照组比较,模型组肺小动脉变窄,管壁增厚,内膜增生,重构现象明显;与模型组比较,β2AR激动剂低、高剂量组肺组织病理改变明显减轻,肺动脉壁增厚现象得到抑制,见图1。

2.3各组肺组织SOD活性及MDA含量比较 与对照组比较,模型组肺组织中SOD活性显著降低,MDA含量显著增高(P<0.05);与模型组比较,β2AR激动剂低、高剂量组肺组织中SOD活性显著升高,MDA含量显著减少(P<0.05);β2AR激动剂低、高剂量组间SOD活性与MDA含量差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.4各组肺组织PCNA表达比较 各组免疫荧光染色结果显示,对照组肺组织可见少量PCNA荧光表达,模型组肺组织中PCNA荧光表达强度明显增加,β2AR激动剂低、高剂量组肺组织中PCNA荧光表达强度较模型组均明显减弱,见图2。

表1 各组RVSP、RVH、肺组织SOD活性与MDA含量、肺组织α-SMA阳性率及BMP4、BMPR2、p-smad1/5/8蛋白表达比较

图1 各组肺组织(HE染色,×200)

箭头所指为阳性表达图2 各组肺组织PCNA表达(免疫荧光染色,×200)

2.5各组肺组织α-SMA表达比较 免疫组化染色结果显示,对照组肺组织中着色细胞少,模型组肺组织着色细胞数明显增加,α-SMA阳性率较对照组显著升高(P<0.05);β2AR激动剂低、高剂量组肺组织中着色细胞数较少,α-SMA阳性率均较模型组显著下降(P<0.05),见表1、图3。

图3 各组肺组织α-SMA表达(免疫组化染色,×400)

2.6各组肺组织BMP4/BMPR2途径蛋白表达 Western印迹结果显示,与对照组比较,模型组肺组织BMP4蛋白相对表达显著上调,而BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表达显著下降(P<0.05);与模型组比较,β2AR激动剂低、高剂量组肺组织BMP4蛋白相对表达显著下调,BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表达显著升高(P<0.05);与β2AR激动剂低剂量组比较,β2AR激动剂高剂量组BMP4蛋白相对表达显著下调,BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表达显著升高(P<0.05),见表1、图4。

1～4:对照组、模型组、β2AR激动剂低剂量组、β2AR激动剂高剂量组图4 各组肺组织BMP4/BMPR2途径蛋白表达

3 讨 论

PAH由各种病因引起肺血管结构和功能的改变,其病因复杂,临床表现多样。尽管目前在了解PAH的发病机制方面取得了重大进展,但尚未开发出有效的治疗方法来逆转肺血管重构、右心衰竭并提高PAH患者的生存率。目前的治疗方法主要针对前列环素、一氧化氮和内皮素信号通路中的血管收缩异常,而对闭塞性血管重塑却不能起到逆转的作用〔4〕,因此,PAH的临床研究旨在寻找改善不可逆肺动脉重塑的新疗法。肺血管重构作为PAH的主要病理特征,包括肺动脉内皮细胞功能障碍、平滑肌细胞过度增殖及外膜成纤维细胞异常活化。而在长期慢性低氧环境下,缺氧诱导因子表达的提高引起了上述几种细胞内血管活性因子、气体信号分子及血管平滑肌内钙离子浓度升高,进而诱发肺血管结构重构〔8〕。本研究发现,大鼠的RVSP和RVH均显著升高,肺动脉结构发生重构,这表明PAH大鼠模型构建成功。

β2AR作为重要的G蛋白耦联受体,其构象的活化或非活化状态与哮喘、心血管疾病及一些自身免疫性疾病密切相关,刺激β2AR可同时激活促凋亡和抗凋亡信号途径,在心力衰竭中促进心肌细胞的生存〔6〕,此外,还有报道指出使用β2AR激动剂非诺特罗能够使高血压心力衰竭大鼠的心功能得到恢复〔9〕。本研究结果显示,经过β2AR激动剂治疗后,PAH大鼠的肺组织病理改变明显减轻,肺动脉壁增厚现象也受到了明显抑制。大量研究表明,氧化应激在PAH中发挥着重要作用,SOD活性下降使得氧自由基清除能力降低,而MDA含量的增高促进了其与氧自由基的结合,提高了肺动脉平滑肌细胞的异常增殖水平,进而促进了肺血管重构〔10,11〕。本研究表明,β2AR激动剂能够抑制低氧诱导的PAH大鼠肺组织SOD活性下降与MDA含量增高,减轻了PAH中氧化应激水平,从而起到治疗PAH的作用。

肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增生是肺血管重构的主要特征,也是PAH发生和发展的病理基础。PASMC中增殖表型标记是PAH患者或PAH动物模型的关键特征〔12〕。本研究结果显示,在PAH大鼠的肺组织中检测到细胞增殖性标记PCNA蛋白表达显著增加,再结合组织病理学染色观察结果,即肺小动脉变窄及管壁增厚、内膜增生的现象,由此推测,PAH大鼠的肺组织中PASMC发生了异常增殖。PASMC具有极强的可塑性,可响应各种环境刺激而从收缩或静止表型去分化为增殖或合成表型。PASMC 经历从收缩到合成的表型转换,这是伴随细胞过度增殖和血管重塑的主要原因,通常情况下,表型转换会限制一些收缩蛋白如α-SMA的表达〔13〕。本研究结果说明,β2AR激动剂可能抑制了PAH大鼠肺组织内PASMC的过度增殖,进而缓解了肺血管重构。

BMPR2及其相关信号通路是肺血管稳态的关键调节因子,据统计,大约有80%的家族性PAH患者和20%的特发性PAH患者携带BMPR2的杂合突变〔14〕。BMPR2基因突变也在其他因素引起的肺动脉高压患者中发现,如先天性心脏病、肺静脉阻塞等〔15,16〕,此外,BMPR2功能减退或丧失也有助于PAH发病机制。目前,越来越多的研究将功能失调的BMPR2相关信号传导(包括 BMPR2、p-smad和BMP4)与PAH的过程发展联系起来,而BMPR2基因的靶向递送对PAH动物模型具有治疗作用〔17〕。在缺氧条件下,缺氧诱导因子(HIF)-1α能够诱导miR-322表达,而miR-322通过靶向BMPR1a和smad5来下调BMPR2信号途径〔18〕。本研究检测结果与先前报道一致,BMP4起初被鉴定为调节软骨细胞生长和分化的分子,现已知其在包括PASMC在内的其他细胞中也能发挥调节生长、分化和凋亡的作用〔19〕。

综上,β2AR激动剂对低氧诱导PAH大鼠具有保护作用,能够减轻PAH中氧化应激水平,抑制BMP4表达而激活BMPR2及下游蛋白smad1/5/8表达,从而改善低氧诱导PAH 大鼠中肺血管重构。然而,在β2AR激动剂介导的低氧诱导PAH肺血管重构中,涉及相关细胞如PASMC增殖的分子机制还有待探索。