超重结肠癌患者肠道菌群特征及其与血清生化指标的相关性

陈雪薇,雷 倩,李一荣

(武汉大学中南医院检验科,武汉 430071)

最新数据显示我国超重人口的比例已高达28.1%[1]。临床研究表明,超重与结肠癌患者远端转移和不良预后呈正相关[2-3]。人体肠道中存在大量的微生物群与机体的相互作用可直接或间接地影响身体健康和疾病进展[4]。文献报道高脂饮食可通过肠道菌群及其代谢产物促进结肠癌发生、发展[5-6]。肿瘤患者常常存在全身性的代谢紊乱,使机体长期处于一种中低强度的应激状态,导致预后不良[7]。因此,本研究采用 16S rDNA 测序技术研究超重与BMI正常结肠癌患者肠道菌群的差异性,并分析核心菌属与血清生化指标的相关性,为进一步研究超重调节结肠癌恶性进展的机制提供依据,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年6—12月于本院治疗的88例结肠癌患者为研究对象,其中男50 例,女38例,年龄(57.68±9.38) 岁。纳入标准:(1)确诊为结肠癌;(2)BMI为18.5～28.0 kg/m2;(3)无家族性腺瘤性息肉、遗传性结肠癌或炎症性肠病的患者;(4)未经过手术、放化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗;(5)在收集标本之前3个月内未应用过抗生素或益生菌。根据BMI将研究对象分为正常组(BMI 18.5～<24.0 kg/m2,n=55)和超重组(BMI 24.0～28.0 kg/m2,n=33),两组一般资料比较,差异无统计学意义(P<0.05),具有可比性,见表1。本研究获得医院伦理学委员会批准(审批号:临研伦[2021041])。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1粪便标本的采集和保存

采集所有研究对象新鲜自然排出的粪便约2 g,装入2 mL试管中,保存于液氮中。标本通过干冰寄送至广州基迪奥生物科技有限公司进行测序分析。

1.2.216S rDNA测序与分析

采用试剂盒(广州美基生物科技有限公司)提取粪便DNA。取质量合格的DNA(30 ng/μL)对16S rDNA目标区域进行扩增,使用AMPure XP Beads(美国贝克曼库尔特公司)对PCR扩增产物进行纯化。定量后,根据 Novaseq6000的PE250模式pooling上机测序。通过α和β多样性分析反映两组微生物群落的多样性。基于样品菌群的相对丰度对标本做主坐标分析(principal co-ordinate analysis,PCoA)。通过PICRUSt软件对肠道菌群功能进行预测,组间差异比较采用STAMP软件实现。

1.2.3血清生化指标的检测

血红蛋白、白蛋白、球蛋白、血糖、尿酸、尿素氮和肌酐等血清生化指标由贝克曼血液分析仪或雅培全自动生化分析仪检测。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组粪便肠道菌群多样性分析

α多样性分析结果显示,两组香农指数、辛普森指数和菌种多样性指数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。PCoA分析结果显示,两组标本均未能各自聚集成簇,采用Weighted-unifrac计算β多样性,差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

A:α多样性分析;B:PCoA分析。

2.2 两组粪便肠道菌群结构分析

选用相似水平为99%的分类单元(operational taxonomic unit,OTU)标本表进行聚类,绘制Venn图。两组88个标本共产生964个OTU,其中两组共有的OTU为572个,超重组特有的OTU为201个,正常组特有的OTU为191个。

在门水平上,两组粪便中的优势菌门主要是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)组成,占总群落的98%以上。在属水平上,超重组粪便中Tyzzerella_4、Lachnospiraceae_UCG-010、Sediminibacterium、Candidatus_Stoquefichus、Morganella、Delftia、Cutibacterium、Ochrobactrum及Johnsonella的平均相对丰度明显高于正常组,而Lachnoclostridium、CAG-873、Dysgonomonas、Pyramidobacter、Facklamia、Methanosphaera及GCA-900066575的平均相对丰度明显低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 两组粪便关键物种分析

菌群进化树状图结果显示超重组肠道富集的菌群分布较广泛,线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)结果显示两组菌群富集不同,见图2。

2.4 两组肠道菌群功能预测分析

两组Level3类别上存在9种差异表达的功能,超重组Ⅱ型酮化合物的生物合成、甘油脂代谢、磷酸戊糖途径、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、非同源性末端接合和糖酵解/糖异生较正常组减弱,而甾体激素生物合成、α亚麻酸代谢和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)受体相互作用较对照组增强,见图3。

图3 两组肠道菌群功能预测分析

2.5 粪便关键菌属与血清生化指标之间的相关性分析

Spearman分析结果显示,Tyzzerella_4与BMI呈正相关(r=0.286,P=0.007),Dysgonomonas与白蛋白球蛋白比值呈正相关(r=0.237,P=0.027),Pyramidobacter与尿酸水平呈负相关(r=—0.292,P=0.006),见图4。

a：P<0.05,明显相关。

3 讨 论

结肠癌是发病率最高的消化道肿瘤,超重是结肠癌发病的风险因素[8-9]。近年来超重人群在我国的迅速增加,因此超重在结肠癌发生、发展中的作用及其机制成为亟须破解的医学问题。文献报道,肥胖或高脂饮食诱导的肠道菌群紊乱均可加剧结肠癌恶性进展[10]。因此本研究通过对BMI正常和超重结肠癌患者的粪便菌群结构进行比较,分析肠道核心菌属及其与血清生化指标的相关性,有望为研究超重在结肠癌进展中的作用及其机制提供依据。

本研究通过16S rDNA测序分析发现,BMI正常和超重结肠癌患者肠道菌群多样性无明显差异。比较两组结肠癌患者肠道菌群结构,在属水平上,超重组粪便中Tyzzerella_4、Lachnospiraceae_UCG-010、Sediminibacterium、Morganella和Delftia等平均相对丰度明显高于正常组,而Lachnoclostridium、CAG-873、Dysgonomonas、Pyramidobacter及Facklamia等平均相对丰度明显低于正常组。LEfSe分析肠道关键菌群结果表明,Tyzzerella_4、Lachnoclostridium、CAG-873、Pyramidobacter、Dysgonomonas和Facklamia可能为结肠癌患者肠道关键菌属。ZHANG等[11]也发现Tyzzerella_4相对丰度在晚期结肠癌患者粪便中明显升高,并可联合粪便免疫化学实验辅助结肠癌诊断。降低肠道中条件致病菌Morganella的丰度能改善局部免疫微环境,保护肠道屏障功能[12]。Dysgonomonas被认为是一种潜在的益生菌,能调节肠道炎症[13]。虽然通过比较发现某一菌群在超重患者肠道中富集或缺失并不能断定其与结肠癌的发生、发展存在因果关系,但找到超重结肠癌患者肠道微生态中的核心菌群可能为研究肥胖促结肠癌进展的机制提供重要依据。

为了进一步探究超重对结肠癌患者肠道菌群功能的影响,本研究利用PICRUSt对肠道菌群功能预测后发现,超重组肠道菌群的Ⅱ型酮化合物的生物合成、甘油脂代谢、磷酸戊糖途径、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、非同源性末端接合和糖酵解/糖异生减弱,而甾体激素生物合成、α亚麻酸代谢和ECM受体相互作用增强。既往研究中发现肥胖小鼠肠道菌群的甘油脂代谢明显降低,表明肠道脂肪酸降解水平降低[14]。磷酸戊糖途径的主要产物是还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和磷酸戊糖。NADPH提供各种代谢反应中的供氢体,防止各种蛋白质和酶的氧化[15]。磷酸戊糖是核酸生物合成所必需的,加速磷酸戊糖途径可提高DNA损伤修复的能力[16]。因此,超重组肠道菌群磷酸戊糖途径的减少可能表明肠道抗氧化和DNA损伤修复能力降低。肠道菌群可通过刺激不同的酶来代谢甾体激素[17-18]。研究发现,血清甾体激素水平与结肠癌患者结肠腺瘤样息肉(adenomatous polyposis coli,APC)基因突变相关[19]。

本研究进一步分析了肠道核心菌属相对丰度与血清生化指标的相关性,发现超重结肠癌患者肠道核心菌属(Tyzzerella_4、Dysgonomonas和Pyramidobacter)与BMI、白蛋白球蛋白比值及尿酸明显相关。BMI是判断人群肥胖程度的重要指标,临床研究发现BMI增加与结肠癌的发病率升高密切相关[20-21]。Tyzzerella_4是一种与不良饮食和肥胖相关的条件致病菌[22]。Tyzzerella_4可通过降低抗肿瘤的细菌代谢产物丁酸分泌,促进肿瘤细胞增殖,从而加速肿瘤恶性进展[23]。白蛋白球蛋白比值通常代表肝脏或肾脏对白蛋白的合成及代谢情况与免疫器官产生的球蛋白之间的平衡[24]。超重的结肠癌患者常伴有内脏肥胖,机体处于一种慢性炎症状态,免疫器官生成大量免疫球蛋白,调节机体免疫环境。Dysgonomonas可维持肠道菌群的动态平衡减轻病原体导致的肠道炎症[25]。尿酸是嘌呤代谢的终产物,主要通过肾脏排泄。临床研究发现,血尿酸水平升高与结肠癌转移及不良预后呈正相关[26]。慢性肾病患者血尿酸升高时,肠道中Pyramidobacter相对丰度明显降低[27]。但这些核心肠道菌属影响结肠癌进展的机制尚不明确,需要进一步的研究及验证。

综上所述,与正常BMI的结肠癌患者比较,超重结肠癌患者肠道菌群中益生菌丰度进一步减少,调节免疫环境和炎症反应的致病菌丰度增加,且肠道核心菌属与血清生化指标白蛋白球蛋白比值和尿酸明显相关。但粪便微生物群易受生活习惯和饮食结构影响,本研究选择的均是同一医院就诊的结肠癌患者,患者日常生活和饮食习惯不同存在一定影响,未来仍需通过前瞻性、多中心研究及更加细化的分组比较来验证本研究结论。