硒化合物对乙醇代谢物损伤的间充质干细胞体外增殖的影响

陈 凤,徐晓敏,吴丰勇,王 菲

(中山大学附属第七医院消化医学中心,广东深圳 518107)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有来源广泛、免疫原性低、分泌大量细胞因子抑制炎性反应,以及分化成各种细胞的能力[1],在多种组织器官再生中具有巨大潜力,如肝脏、肾脏、神经、心脏、骨及皮肤再生等[2-3]。研究发现损伤部位普遍存在的促炎症和促氧化的宿主环境,大大降低了移植细胞的存活率,较大程度限制了MSCs的临床应用[4]。硒化合物具有很强的抗氧化作用,研究已证实硒在人体中具有清除自由基、抵抗有害重金属、免疫调节、保护肝脏等器官的重要作用[5]。有研究报道乙醇及其代谢物诱导的氧化损伤环境会破坏干细胞DNA[6]。因此,本研究拟通过在体外模拟乙醇代谢过程中形成的乙醇代谢产物诱导氧化应激环境来分析硒化合物对MSCs体外增殖的影响。乙醇进入细胞后主要在乙醇脱氢酶和细胞色素酶P450作用下氧化分解为乙醛,后者在乙醛脱氢酶作用下氧化为乙酸,这些乙醇代谢物可通过脂质过氧化破坏线粒体膜和细胞膜,造成细胞损伤[7]。至今尚未见有关于硒化合物在乙醇代谢过程中如何影响MSCs体外增殖的报道。因此本研究选取硒甲基硒代半胱氨酸(Se-methylselenocysteine hydrochloride,Se-c)、依布硒啉(Ebselen,Eb)、硒代蛋氨酸(Selenomethionine,Se-M)3种硒化合物,分析它们对乙醇、乙醛、乙酸损伤的人脂肪MSCs(human adipose mesenchymal stem cells,hADSCs)和人脐带MSCs(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUMSCs)体外增殖的影响,为提高干细胞移植治疗后的抗应激能力奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

hADSCs和hUMSCs购自赛业生物科技有限公司,高糖DMEM培养基、胎牛血清、青-链霉素、胰蛋白酶-EDTA(0.25%)、二甲基亚砜(DMSO)购自Gibco公司,Se-c(M6680)和Se-M (S3132)购自Sigma公司,Eb (70530)购自Cayman公司,乙醇、乙醛、乙酸溶液均购自Aladdin公司,CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒购自Promega公司,本实验中细胞正常培养液为高糖DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青-链霉素。

1.2 方法

1.2.1细胞活力测定

采用CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒进行测定,使用时将缓冲液与底物瓶混匀,96孔板细胞中每孔加入50 μL的CellTiter-Glo混合试剂,随后将孔板放入定轨摇床中,90 rpm混合内容物2 min诱导细胞裂解;将平板室温孵育10 min使荧光信号稳定,在酶标仪化学发光选项中读取560 nm处的荧光信号值。

1.2.2乙醇代谢物诱导MSCs损伤的半数抑制浓度(IC50)值测定

将传代培养至P4的hADSCs和hUMSCs按照每孔2 000个细胞的密度接种于96孔板中,24 h后去除原培养液,分别加入使用细胞培养液稀释为不同浓度的乙醇、乙醛和乙酸溶液。乙醇依次稀释为1 600、800、400、200、100、50、25、10、0 mmol/L,乙醛依次稀释为40、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0 mmol/L,乙酸依次稀释为250、200、150、100、75、50、25、10、5、2、0 mmol/L;每个浓度设置5个重复孔,在乙醇代谢物作用于细胞24 h后进行细胞活力检测,根据IC50值建立细胞氧化应激模型。

1.2.3硒化合物对MSCs增殖活力的影响

根据操作说明书将3种硒化合物稀释为储存浓度进行保存,同上进行细胞铺板后,分别加入依次稀释为10、5、2、1、0.5、0.25、0.1、0.01、0 μmol/L浓度的3种硒化合物,于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h后进行细胞活力检测。基于相关文献[8-9]的报道及实验结果,分别选取1 μmol/L和3 μmol/L浓度的Se-c、Eb、Se-M用于后续的研究。

1.2.4硒化合物对乙醇代谢物损伤的MSCs增殖活力的影响

同上操作,将细胞接种在96孔板中, 分别加入1 μmol/L和3 μmol/L浓度的3种硒化合物溶液,继续培养24 h后将培养液更换为含有相应浓度硒化合物和不同乙醇代谢物的培养液,24 h后检测细胞活力。其中空白对照组加入等量的细胞培养液,实验对照组使用乙醇代谢物(不含硒化合物)进行预处理。

1.3 统计学处理

采用SPSS26.0统计软件进行数据分析,多组间的比较先采用单因素方差分析,如果组间差异有统计学意义,进一步采用LSD-t检验进行两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乙醇代谢物作用于MSCs的IC50值测定

乙醇代谢物作用于不同MSCs的IC50值测定结果如图1所示,乙醇、乙醛、乙酸诱导hADSCs和hUMSCs损伤的IC50值分别为230.2 mmol/L和199.9、1.32 mmol/L和1.30、24.21 mmol/L和18.66 mmol/L。

图1 乙醇代谢物作用于hADSCs和hUMSCs的IC50值测定

2.2 硒化合物对不同MSCs增殖活力的影响

分别添加不同浓度的Se-c、Eb、Se-M至hADSCs和hUMSCs中检测细胞增殖活性的变化。结果显示在hADSCs中,0.5～10.0 μmol/L的 Se-c、0.1～2.0 μmol/L的Eb、0.5～2.0 μmol/L的Se-M相较对照组均能明显提高细胞活力(P<0.05),见图2A～C。在hUMSCs中,0.1～10.0 μmol/L的Se-c、0.1～1.0 μmol/L的Eb、0.25～5.0 μmol/L的Se-M相比对照组的细胞增殖活性均有明显提高(P<0.05),见图2D～F。

A～C:hADSCs;D～F:hUMSCs;a：P<0.05。

2.3 硒化合物对乙醇代谢物损伤的MSCs增殖活力的影响

硒化合物预处理后检测乙醇代谢物损伤的MSCs增殖活性的改变,见图3。与空白对照组相比,乙醇、乙醛、乙酸处理组均明显降低了两种细胞的增殖活性(P<0.05);与实验对照组相比,1 μmol/L和3 μmol/L的Se-c、Eb、Se-M能有效提高乙醇损伤后的hADSCs增殖活力,其中3 μmol/L Eb和1 μmol/L Se-M组的细胞活性明显高于1 μmol/L Eb组和3 μmol/L Se-M组(P<0.05);在乙醛损伤hADSCs的研究中,只有Se-c和Eb可以提高损伤后的细胞活力,且1 μmol/L Eb组的改善效果较3 μmol/L Eb组明显(P<0.05)。3种硒化合物均对乙酸损伤后的细胞活性没有改善作用,反而更进一步降低了细胞活力。此外,与实验对照组相比,只有3 μmol/L Se-c和Se-M组明显提高了乙醇处理后的hUMSCs活性,3 μmol/L Se-c、Eb和Se-M明显改善了乙醛损伤后的hUMSCs活性(P<0.05)。

A～C:hADSCs;D～F:hUMSCs;①:空白对照组;②:实验对照组;③:1 μmol/L Se-c组;④:3 μmol/L Se-c组;⑤:1 μmol/L Eb组;⑥:3 μmol/L Eb组;⑦:1 μmol/L Se-M组;⑧:3 μmol/L Se-M组;a：P<0.05,与①比较;b：P<0.05,与②比较;c：P<0.05,与相同硒化合物(1 μmol/L)比较。

2.4 不同硒化合物对乙醇代谢物损伤的MSCs增殖活力的影响比较

进一步对3种硒化合物在乙醇和乙醛损伤的MSCs的增殖活力进行比较分析,结果见图4。在乙醇损伤hADSCs中, 3 μmol/L Eb组的细胞活力明显高于其他硒化合物组(P<0.05);在乙醛损伤hADSCs中,1 μmol/L Eb组的细胞活力最高,与3 μmol/L Se-M组差异无统计学意义(P>0.05),但明显高于其他组(P<0.05)。在乙醇损伤hUMSCs中,3 μmol/L Se-c和1 μmol/L Se-M改善细胞活力的效果最好,3 μmol/L Se-M在乙醛损伤hUMSCs中的细胞活力最高,明显高于Se-c和1 μmol/L Eb组(P<0.05),但与3 μmol/L Eb和1 μmol/L Se-M组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A～B:hADSCs;C～D:hUMSCs;①:1 μmol/L Se-c组;②:3 μmol/L Se-c组;③:1 μmol/L Eb组;④:3 μmol/L Eb组;⑤:1 μmol/L Se-M组;⑥:3 μmol/L Se-M组;a：P<0.05。

3 讨 论

通过增强MSCs的抗应激能力对各种疾病的治疗效果有积极影响,研究表明基因修饰、预处理和优化培养条件是提高MSCs体内外功能的关键策略,预处理能够提高MSCs的细胞活力、旁分泌效应、分化效能以及进入损伤部位的归巢能力等[10]。硒最重要的生物学效应就是抗氧化作用,研究显示硒在羊水MSCs的体外扩增和多能性维持方面发挥着关键作用,通过激活ERK1/2、AKT、NF-κB等信号通路增强了细胞的增殖迁移能力以及促进了体内伤口的愈合[11]。但是截至目前,关于硒化合物对脂肪和脐带来源MSCs在体外培养过程中的影响尚不清楚,因此本研究旨在以硒化合物为中心探讨其对乙醇代谢损伤MSCs的影响,以期为促进再生医学的发展提供实验依据和理论基础。

本研究结果显示3种乙醇代谢物在hADSCs的IC50值均分别高于hUMSCs,表明它们诱导hUMSCs损伤的作用更强,侧面也反映hADSCs在乙醇暴露情况下的抗应激能力更高,可能与hADSCs在体外耐受细胞凋亡的能力更强有关[12],项目组前期开展的研究也表明hADSCs具备更强的增殖能力[13]。进一步的研究结果显示适宜浓度的硒化合物能够促进MSCs的增殖,小于10 μmol/L的Se-c以及小于2 μmol/L的Eb和Se-M可提高细胞活力。在Shi等人分析硒对体外培养的精原干细胞的增殖和凋亡研究中,发现2 μmol/L硒可通过抑制活性氧的产生、调节细胞周期和凋亡相关基因的表达来促进细胞的增殖,然而高浓度的硒化合物(8 μmol/L和16 μmol/L)会促进细胞的凋亡[9]。另一项研究也表明在冻融培养基中添加5 ng/mL硒可提高细胞中Bcl-2的表达和抗凋亡作用[14]。此外,5 ng/mL硒可以增强hADSCs来源外泌体的活性,减少炎症,促进增殖和迁移,最终导致伤口的愈合[15]。本研究表明硒化合物可改善乙醇和乙醛损伤的MSCs活力,但在乙酸作用下无效,反而会降低细胞活力,可能是由于硒化合物与乙酸相互作用形成的产物进一步损伤细胞所致。有研究表明,补充硒可缓解乙醇引起的氧化应激,加速乙醇代谢,减少肝细胞损伤等[16-17]。因此如果采用硒预处理生长在乙醇暴露微环境下的细胞,建议在乙醇暴露前或更早的时期开始添加。本研究中Eb在hADSCs以及Se-M在hUMSCs中发挥的效果最好,目前已有较多研究证实二者在人体多个系统的疾病治疗中具有优良的潜在应用前景[18-19],但本实验尚未对硒化合物是否会对MSCs产生其他不利影响进行分析,其最终的效果及机制有待进一步确认。

综上所述,适宜浓度的硒化合物可用于提高乙醇暴露即乙醇和乙醛诱导损伤的MSCs活力,其中Eb用于改善hADSCs以及Se-M用于hUMSCs的效果最好。但采用硒或者其他化合物对细胞进行预处理的适用剂量、是否会对细胞产生不利影响、预处理后细胞移植的成瘤性,以及是否存在其他协同促进的因素等问题还需要更多的研究来阐明,这些问题的解决将会促进再生医学的进一步发展。